[发明专利]D-二聚体时间分辨荧光免疫分析试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.D-二聚体时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征是由下述成分组成：

1)D-二聚体校准品，用下述方法制成：用人血浆或人红血球将D-二聚体抗原纯品稀释成系列浓度，每瓶装0.5毫升每个浓度点，真空干燥，所述D-二聚体抗原纯度≥90％；

2)D-二聚体单克隆抗体包被的微孔板；

3)铕元素标记的另一株D-二聚体单克隆抗体；

4)洗涤液，用下述方法制成：取1.212g三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节pH值为7.8，加去离子水至1000mL，再加入氯化钠9g，加入Tween200.1mL，完全溶解；

5)增强液，用下述方法制成：取1000mL双蒸水，加入3.6mL冰醋酸，0.5g醋酸钠，0.002～0.01gβ-萘甲酰三氟丙酮，0.01～0.05g三辛基氧化膦，1～2mL Triton X-100，混匀；

6)分析缓冲液，用下述方法制成：取6.06三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节pH值为7.8，加去离子水至1000mL，再加入10g牛血清白蛋白，完全溶解。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述D-二聚体单克隆抗体包被的微孔板是用下述方法制成：将D-二聚体单克隆抗体溶解于包被稀释液中，使其浓度为5ug/mL，加入微孔板中，使200μl/孔，37℃放置24小时，用包被稀释液250微升/孔洗板1次，再用质量百分浓度为2％BSA溶液封闭，室温干燥，所述包被稀释液是用下述方法制成：取6.06三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节pH值为7.8，加去离子水至1000mL，再加入10g牛血清白蛋白，完全溶解。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是所述铕元素标记的另一株D-二聚体单克隆抗体是用下述方法制成：将50～100μg D-二聚体单克隆抗体溶于50μl 0.01M pH＝8.5的碳酸盐缓冲液中，加入使用100μl双蒸水溶解的40mg的异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠，在4℃反应12-18小时，将反应液转移到预先用0.05M pH＝7.8 Tris-HCl缓冲液平衡的Sephadex G50柱上层析分离，以0.05M pH＝7.8 Tris-HCl平衡液洗脱，自动收集，用紫外分光光度计检测蛋白浓度，收集第一个大峰。

4.D-二聚体时间分辨荧光免疫分析试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)配制D-二聚体校准品，配制方法是：用人血浆或人红血球将D-二聚体抗原纯品稀释成系列浓度，每瓶装0.5毫升每个浓度点，真空干燥，所述D-二聚体抗原纯度≥90％；

2)制备D-二聚体单克隆抗体包被的微孔板；

3)制备铕元素标记的另一株D-二聚体单克隆抗体；

4)配制洗涤液，配制方法为：取1.212g三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节pH值为7.8，加去离子水至1000mL，再加入氯化钠9g，加入Tween200.1mL，完全溶解；

5)配制增强液，配制方法为：取1000mL双蒸水，加入3.6mL冰醋酸，0.5g醋酸钠，0.002～0.01gβ-萘甲酰三氟丙酮，0.01～0.05g三辛基氧化膦，1～2mL Triton X-100，混匀；

6)配制分析缓冲液，配制方法为：取6.06三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节pH值为7.8，加去离子水至1000mL，再加入10g牛血清白蛋白，完全溶解。

5.根据权利要求书4所述的制备方法，其特征在于所述D-二聚体单克隆抗体包被的微孔板是用下述方法制成：将D-二聚体单克隆抗体溶解于包被稀释液中，使其浓度为5ug/mL，加入微孔板中，使200μl/孔，37℃放置24小时，用包被稀释液250微升/孔洗板1次，再用质量百分浓度为2％BSA溶液封闭，室温干燥，所述包被稀释液是用下述方法制成：取6.06三羟甲基氨基甲烷，溶于900mL去离子水中，用盐酸调节pH值为7.8，加去离子水至1000mL，再加入10g牛血清白蛋白，完全溶解。

6.根据权利要求书4所述的制备方法，其特征在于所述铕元素标记的另一株D-二聚体单克隆抗体是用下述方法制成：将50～100μg D-二聚体单克隆抗体溶于50μl 0.01M pH＝8.5的碳酸盐缓冲液中，加入使用100μl双蒸水溶解的40mg的异硫氰酸苄基二亚乙基三胺四乙酸铕钠，在4℃反应12-18小时，将反应液转移到预先用0.05M pH＝7.8 Tris-HCl缓冲液平衡的Sephadex G50柱上层析分离，以0.05M pH＝7.8 Tris-HCl平衡液洗脱，自动收集，用紫外分光光度计检测蛋白浓度，收集第一个大峰。