[发明专利]山羊可诱导多能干细胞的制备方法

权利要求书

1.一种山羊可诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)构建携带转录因子的慢病毒载体，所述转录因子选自：Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4，Lin28、Nanog、hTert、SV40 largeT antigen；

B)采用步骤A)所得慢病毒载体，将所述转录因子以组合形式感染山羊成体细胞，挑选形态类似胚胎干细胞的克隆传代培养，通过筛选符合胚胎干细胞特性的细胞克隆，得到山羊可诱导多能干细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述山羊成体细胞为原代耳尖成纤维细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述慢病毒载体以组合形式携带的转录因子的组合形式为：Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28、Nanog、hTert、SV40 largeT antigen。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B)的传代培养是将山羊iPS克隆按1∶5～10的比例传至辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞上。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤B)的筛选是筛选碱性磷酸酶染色呈阳性的细胞。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤C)山羊可诱导多能干细胞的干细胞多能性鉴定。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述干细胞多能性鉴定包括检测以下指标：

1)碱性磷酸酶表达呈阳性；

2)干细胞表面特异标记SSEA-1(+)、Rex1(+)、SSEA-3(-)、SSEA-4(-)、Tra-1-60(+)、Tra-1-81(+)、E-Cadherin(+)；

3)自然分化形成胚状体后，外胚层NeuroD(+)、Fibronectin(+)，中胚层Myf5(+)、Enolse3(+)、VEGFR2(+)和内胚层DCN1(+)、AFP(+)；

4)随机分化后，免疫荧光检测到外胚层Tuj1(+)、GFAP(+)，中胚层a-SMA(+)、Myotube(+)，内胚层FoxA2(+)；

5)山羊可诱导多能干细胞注射先天性免疫缺陷小鼠后形成畸胎瘤。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述指标4)形成的畸胎瘤具有外胚层、中胚层和内胚层。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述山羊可诱导多能干细胞的干细胞多能性鉴定还包括检测指标6)Nanog基因的启动子区域被去甲基化。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述山羊可诱导多能干细胞在撤去DOX后关闭外源基因表达。