[发明专利]用于灵菌红素生物合成的缩合酶

说明书

技术领域

本发明属于生物制药相关的基因工程领域，涉及一种用于灵菌红素生物合成的缩合酶。

背景技术

灵菌红素是一类主要由一些放线菌、沙雷氏菌及其它海洋细菌产生的具有重要生物活性的典型次级代谢产物。含甲氧基三吡咯环组成的基本骨架结构，具有抗细菌、抗疟疾、抗真菌、抗原生动物等生物活性。近年来，发现其具有特效的免疫抑制和抗癌活性，其中灵菌红素类似物GX15-070(Obatoclax)，在临床上已被用于治疗多种癌症，主要作用机理在于：①作为细胞内pH值调节器；②具有铜离子诱导DNA裂解活性；③激活蛋白激酶(MAPK)作为细胞有丝分裂的调节剂；④作为细胞周期的抑制剂。另外国内外研究还表明灵菌红素及其类似物在水体污染治理，特别是由各种藻类造成的海洋赤潮和淡水水华等方面具有极佳的治理效果，且不会给水体环境带来二次污染。灵菌红素及其类似物作为生态染料，在羊毛、腈纶等纺织品染色方面，具有较好的色牢度、上染率及抗菌性能。

基于灵菌红素特效免疫抑制和抗癌活性，它的合成成为研究的热点。现主要采用两种途径：化学合成和生物合成。①化学合成法从二十世纪六十年代，就有关于灵菌红素化学合成的报道，后来研究者陆续报道了不同工艺路线，大多是通过对现有的灵菌红素分子进行化学改性，合成新的灵菌红素类似物，已有研究表明通过化学合成的一些灵菌红素结构类似物较灵菌红素更为高效低毒，比如类似物GX15-070(Obatoclax)，已进入II期临床试验，但产量产率均较低。

生物法合成灵菌红素具有对环境友好、成本低等优点，备受关注。目前国内外较多关于发酵生产灵菌红素的研究报道，主要从菌株选育、营养条件、环境因素、培养方式、反应设备等方面进行考察，产量差异很大。通过对灵菌红素的生物合成途径深入研究，发现在参与灵菌红素的基因约有二十个左右，在不同生物体中不尽相同，但均组成基因簇。主要存在四种不同的基因簇组成，每个基因簇基因组成。一些研究表明组成灵菌红素合成的基因簇的一些酶，表现出对底物利用和产物形成的灵活性，其中催化灵菌红素合成最终步骤的灵菌红素缩合酶PigC，在催化前体2-甲基-3-戊基吡咯(MAP)和4-甲氧基-2，2′-二吡咯-5-羧甲基乙醛(MBC)合成中灵菌红素过程中，也表现出松弛的底物专一性，具有催化前体类似物合成灵菌红素类似物的能力，属于典型的混杂酶，在利用组合生物合成方法开发灵菌红素类似物中将起到关键作用，并在混杂酶机理研究及生物制药方面具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于灵菌红素生物合成的缩合酶，实现开发高效合成灵菌红素及类似物的基因产品奠定基础。

本发明所述的一种用于灵菌红素生物合成的缩合酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其相应的DNA序列如SEQ ID No.2所示。

本发明从Serratia marcescens菌株中提取总DNA，采用分段克隆方法获得灵菌红素缩合酶基因全长，分析测定核苷酸序列并研究其特性。

第一步，基因组DNA提取：

将Serratia marcescens jx-1(中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为：CGMCC4074)菌种过夜培养于LB液体培养基中，收集菌体重悬于TE溶液中，分别利用溶菌酶、蛋白酶K和10％SDS裂解菌体，再采用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提去除蛋白质，重复两次，再用0.6倍体积的异丙醇沉淀，用75％的乙醇洗涤，自然风干，加适量ddH₂O溶解，4℃储存备用。

第二步，PCR分段扩增：

我们根据Genbank数据库中公布来源于Serratia marcescens的PigC序列，利用Premier5.0软件设计了四条引物，分别为：引物1：5’-tggatccgaggtgatgtcatgaatc-3’(BamHI)，引物2：5’-agccccatggttttgatcgccgggccatg-3’(NcoI)，引物3：5’-cccggcgatcaaaaccatggggct-3’(NcoI)，引物4：5’-taaagcttcgcatcaccttcgttg-3’(HindIII)。采用分段克隆的方法，获得PigC基因的全片段。

第三步，大肠杆菌感受体细胞的制备：