[发明专利]一种对转入玉米的Bar基因进行筛选的方法

权利要求书

1.一种对转入玉米的Bar基因进行筛选的方法，其特征在于：包括以下步骤：

经过预培养的外植体接种于携带双元质粒p3300的农杆菌菌株EHA105的菌液中侵染，浸染后的外植体经共培养、含有草甘膦的筛选培养基I与筛选培养基II中筛选，再依次经过再生培养基I与再生培养基II中再生培养诱导形成胚状体和苗体，选择苗体盆栽得到的抗性植株，再用PCR检测和经凝胶电泳法证实筛选获得阳性植株为转基因植株；所述的双元质粒p3300是在其上的T-DNA区含有八氢番茄红素合成酶基因(PSY)和PPT乙酰转移酶基因(Bar)。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的农杆菌菌液是将携带双元质粒p3300的农杆菌菌株EHA105的单菌落接种于含100mg/l卡那霉素的YEP培养液中，28℃、160rpm振荡培养12h，当细菌达到对数生长期时，4℃、4000rpm离心收集菌体，重悬于感染培养基，菌液浓度为OD₆₀₀＝0.6-0.8。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的外植体的预培养是取自交系的8-13d的幼雌穗，表面用75％的酒精消毒，再用0.1％的氯化汞浸泡8分钟，无菌水洗3次后挑取幼胚接种在诱导培养基上，24℃条件下暗培养7～10d后，拔去生长出的微芽，转入新鲜的诱导培养基上，继代2～3周产生I型愈伤组织，继代1～2次后产生II型愈伤组织，每14d继代1次；取生长旺盛的II型愈伤组织作为农杆菌转化的受体材料；所述的诱导培养基的组成为：MS大量50mL+MS微量5mL+B₅有机5mL+铁盐5mL+1.5mg/L2，4-D+500mg/L脯氨酸+250mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+5μM/L AgNO₃，pH为5.8-6.2。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的预培养后的外植体共培养，即生长旺盛的外植体接种于制备好的农杆菌菌液中，使外植体与农杆菌充分接触15-20min，再置于含100μmol/L乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)的共培培养基上，25℃下避光培养3～5天后，将玉米愈伤组织用无菌水冲洗3遍，转入延迟培养基中28℃延迟培养7天；所述的共培培养基的组成为：MS大量50mL+MS微量5mL+B₅有机5mL+铁盐5mL+1.5mg/L2，4-D+500mg/L脯氨酸+250mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+500mg/LMES+10g/L葡萄糖+100μmol/LAS+5μM/LAgNO₃，pH 5.8-6.2。所述的延迟培养基的组成为：MS大量50mL+MS微量5mL+B₅有机5mL+铁盐5mL+1.5mg/L2，4-D+500mg/L脯氨酸+250mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+5mg/L草甘膦+400mg/L头孢霉素+5μM/L AgNO₃，pH 5.8-6.2。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的筛选是将延迟培养的愈伤组织放入含有5mg/L草甘膦的筛选培养基I中25℃下避光培养筛选两周(低压筛选)。所述的筛选培养基I的组成为：MS大量50mL+MS微量5mL+B₅有机5mL+铁盐5mL+1.5mg/L2，4-D+500mg/L脯氨酸+250mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+5mg/L草甘膦+400mg/L头孢霉素+5μM/LAgNO₃，pH 5.8-6.2；

然后，将上述新鲜愈伤组织转接到含有10mg/L草甘膦的筛选培养基II(高压筛选)上25℃下避光培养筛选2-3次，每次2周，得到抗性的愈伤组织。所述的筛选培养基II的组成为：MS大量50mL+MS微量5mL+B₅有机5mL+铁盐5mL+1.5mg/L2，4-D+500mg/L脯氨酸+250mg/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+7g/L琼脂+10mg/L草甘膦+400mg/L头孢霉素+5μM/LAgNO₃，pH 5.8-6.2。