[发明专利]葡糖淀粉酶变体

说明书

本申请是申请日为2006年11月17日、申请号为200680042983.9(国际申请号为PCT/DK2006/000638)、发明名称为“葡糖淀粉酶变体”的发明申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及具有改进性质的葡糖淀粉酶变体和使用所述葡糖淀粉酶变体的方法。

背景

葡糖淀粉酶(1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶(1，4-alpha-D-glucan glucohydrolase)，EC 3.2.1.3)是催化D-葡萄糖从淀粉或相关的寡糖和多糖分子的非还原端释放的酶。葡糖淀粉酶由几种丝状真菌和酵母产生。

商业上，使用葡糖淀粉酶将已经用α-淀粉酶部分水解的玉米淀粉转化为葡萄糖。在高果糖玉米糖浆(HFCS)生产中，通过葡萄糖异构酶进一步将葡萄糖转化为由几乎相等的葡萄糖和果糖组成的混合物。这种混合物是普遍使用的高果糖玉米糖浆，其商业化遍布全球。对于高果糖玉米糖浆使用最多的是源自埃默森踝节菌(Talaromyces emersonii)和黑曲霉(Aspergillus niger)的葡糖淀粉酶。

在商业上用于高果糖玉米糖浆生产的高固体浓度下，葡糖淀粉酶由通过缩合产生的葡萄糖合成二糖、三糖和四糖。这种情况的发生是由于淀粉中α-(1-6)-D-糖苷键的缓慢水解和由D-葡萄糖形成多种积累的缩合产物，主要是异麦芽糖。因此，转化方法中的葡萄糖产率不超过理论产率的95％。全世界通过这种方法产生的HFCS量非常大，而在每吨淀粉的葡萄糖产率上即使非常小的增加在商业上也是重要的。

本发明的目的是减少特定葡糖淀粉酶的缩合产物的形成，所述葡糖淀粉酶可以从真菌生物，特别是踝节菌属(Talaromyces genus)和曲霉属(Aspergillus genus)的菌株获得，并且已经基于它们的合适性质，例如淀粉转化中的性质，对所述葡糖淀粉酶本身进行了选择。

发明简述

申请人们目前发现通过在亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列的特殊区域中的特殊位置引入一些变化，来降低形成α-(1-6)键的速率，和/或减少异麦芽糖的形成。葡糖淀粉酶切割并因而形成α-(1-6)键的速率相对于其切割α-(1-4)键的速率的降低具有实际意义。葡糖淀粉酶能够在副产品量显著减少的情况下产生葡萄糖，这将有重要的商业意义，例如，从淀粉生产甜味剂时。

本发明的发明人提供了亲本葡糖淀粉酶的许多变体，所述变体显示减少的缩合。通过在糖化方法中使用本发明的葡糖淀粉酶变体，能够产生具有非常高葡萄糖百分比的糖浆。通过突变，例如通过在亲本葡糖淀粉酶中取代和/或缺失和/或插入选择的位置来获得减少的缩合。这将在下文中详细描述。

因此，在第一个方面，本发明涉及亲本葡糖淀粉酶的变体，当与亲本葡糖淀粉酶比较时，所述变体葡糖淀粉酶的缩合产物产量减少。

因此，在第二个方面，本发明涉及亲本葡糖淀粉酶的变体，其在以下区域之一中包含变化：区域248-255，例如在位置248、249、250、251、252、253、254和/或255的一个或多个中，区域309-318，例如在位置309、310、311、312、313、314、315、316、317和/或318的一个或多个中，和/或区域409-415，例如在位置409、410、411、412、413、414和/或415的一个或多个中，其中(a)所述变化独立地是(i)在占据该位置的氨基酸的下游插入氨基酸，(ii)缺失占据该位置的氨基酸，或(iii)用不同的氨基酸取代占据该位置的氨基酸，(b)所述变体具有葡糖淀粉酶活性，并且(c)各位置相应于亲本葡糖淀粉酶的氨基酸序列的区域或位置，所述亲本葡糖淀粉酶具有SEQ ID NO：1的氨基酸序列，和/或相应于同源葡糖淀粉酶中的区域或位置，所述同源葡糖淀粉酶与SEQ ID NO：1中所示氨基酸序列具有至少50％同一性程度。

在第三个方面，本发明涉及DNA构建体，其包含编码根据第一个方面的葡糖淀粉酶变体的DNA序列。

在第四个方面，本发明涉及重组表达载体，其携带根据第二个方面的DNA构建体。

在第五个方面，本发明涉及细胞，将所述细胞用根据第二个方面的DNA构建体或根据第三个方面的载体转化。

在第六个方面，本发明涉及根据第四个方面的细胞，所述细胞是微生物，尤其是细菌或真菌。

在第七个方面，本发明涉及用于将淀粉或部分水解的淀粉转化为含有葡萄糖(dextrose)的糖浆的方法，所述方法包括在根据第一个方面的葡糖淀粉酶变体存在下糖化淀粉水解物。