[发明专利]胞二磷胆碱的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种胞二磷胆碱的制备方法，属于生物技术领域。

背景技术

胞二磷胆碱，又名胞苷二磷酸胆碱，中国药典2005年版定名为胞磷胆碱，英文名：Citichaline，它的化学名称：胆碱胞嘧啶核苷-5’-二磷酸酯。它是卵磷脂生物合成的前体，当大脑功能下降时，脑组织内的卵磷脂含量显著减少。补充外源性胞二磷胆碱即能激活卵磷脂的生物合成，刺激脑干网状结构的兴奋，提高苏醒阈值，恢复神经组织机能，改善脑代谢和神经传导，提高患者的意识水平。

上世纪50年代由kennedy博士等人发现并确定分子结构，稍后Rossiter等阐明其功能。70年代初，日本武田制药株式会社研发并用于治疗脑外伤，脑手术伴随的意识障碍的临床获得成功，其商品名：Nichdin，中译名：尼柯灵。我国自70年代中期，华东师范大学生化教研室和天厨味精厂等单位协作，首先采用啤酒酵母作酶促生物发酵，稍后又进行了化学合成的探索，并在上海华山医院、上海市第一人民医院、新华医院等脑外科和神经内科进行约二年期的临床应用。目前，胞二磷胆碱已作为脑外科、神经内科以及不同类型的老年痴呆症用药。因此，对它的需求量很大，目前国内市场已达60吨上下，且出口量也与日俱增。

胞二磷胆碱的合成方法主要有化学合成法、酶法和微生物转化法等方法， 但是，前两种方法由于成本太高，现在已经不再采用。目前常用的方法是微生物转化法，利用微生物的细胞酶系合成。由于细胞具有维持其生命活动的完整的多酶系统，各种酶又保持着原有生活细胞所处的状态和特定位置，因此能够迅速有效地完成多步酶催化反应。然而，现行的胞二磷胆碱的生产方法大多需要由多种微生物参与，使得生产的工艺条件较为苛刻，工艺步骤也较为繁琐；且现行的胞二磷胆碱的生产方法所使用的底物的价格大多较为昂贵，使得生产胞二磷胆碱的成本大为提高。

发明内容

鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种经济、高效，且工艺简单的胞二磷胆碱的制备方法。

本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：

胞二磷胆碱的制备方法，使用单一的基因工程菌的培养物或者其处理物作为酶源，催化包括氯化铵、乳清酸和磷酸胆碱的底物进行反应，使得反应液中生成和积蓄胞二磷胆碱，从所述反应液中提取所述胞二磷胆碱。

进一步地，所述基因工程菌具有可诱导表达磷酸胆碱转胞苷酰酶、乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脱羧酶、尿甘酸激酶、核苷二磷酸激酶和胞苷三磷酸连接酶的基因。

更进一步地，可诱导表达所述磷酸胆碱转胞苷酰酶和胞苷三磷酸连接酶的基因位于所述基因工程菌的质粒上。

更进一步地，可诱导表达所述乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脱羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因位于所述基因工程菌的染色体上。

更进一步地，可诱导表达所述磷酸胆碱转胞苷酰酶的基因核苷酸片段来源 于酿酒酵母。

更进一步地，可诱导表达所述胞苷三磷酸连接酶、乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脱羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因片段来源于大肠杆菌。

更进一步地，所述基因工程菌的制备方法包括如下步骤：

a)将来源于酿酒酵母的可诱导表达所述磷酸胆碱转胞苷酰酶的基因核苷酸片段和来源于大肠杆菌的可诱导表达胞苷三磷酸连接酶的基因核苷酸片段经酶切后与质粒载体连接形成重组质粒；

b)通过同源重组将来源于大肠杆菌的可诱导表达所述乳清苷酸焦磷酸化酶、乳清苷酸脱羧酶、尿甘酸激酶和核苷二磷酸激酶的基因片段插入到宿主细胞的染色体上；

c)将所述重组质粒转入到所述宿主细胞内。

更进一步地，所述质粒载体为质粒pUC18。

更进一步地，所述宿主细胞为原核细胞。

更进一步地，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)采用单一的微生物催化反应，反应条件易于控制；(2)底物成本较低，从而使得胞二磷胆碱的生产成本较低；(3)反应迅速、且转化率较高。

以下便结合实施例附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。

附图说明

图1是实施例中的基因工程菌的部分基因构建的流程图。

具体实施方式

本发明胞二磷胆碱的制备方法是使用单一的基因工程菌的培养物或者其处理物作为酶源，催化包括氯化铵、乳清酸和磷酸胆碱的底物进行反应，使得反应液中生成和积蓄胞二磷胆碱，从所述反应液中提取所述胞二磷胆碱。

【实施例】