[发明专利]黄瓜细菌性角斑病菌检测用引物

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体地说涉及黄瓜细菌性角斑病菌检测用引物。

背景技术

黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)是世界性黄瓜病害，主要侵染黄瓜，该病菌在种子内、外或随病残体在土壤中越冬，远距离传播主要依靠带菌种子。该病目前在世界各地均有分布，在我国主要分布在华北、东北及华中地区。近年来我国黄瓜种植面积不断增大，黄瓜育种产业发展很快，黄瓜种子远距离调运的频次及数量也大幅度增加，因此该病传播及扩散的风险日益增大。

本研究选择黄瓜细菌性角斑病菌gap1基因设计一对引物，建立了黄瓜细菌性角斑病菌的PCR检测方法，反应结束后利用凝胶电泳检测判定是否有黄瓜细菌性角斑病菌。

发明内容

本发明目的在于提供用于黄瓜细菌性角斑病菌PCR检测用引物序列。

本发明通过分析黄瓜细菌性角斑病菌gap1基因序列的基础上，设计了引物。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表PSL-F和PSL-R所示。

本发明还进一步给出了应用上述引物进行PCR检测的方法，其以样品菌液或者植物提取DNA为模板，进行PCR扩增，反应结束后根据电泳检测扩增片段判定结果。

具体地说本发明以样品菌液或者植物提取DNA为模板，进行PCR反应，即在25μL反应体系中加入18.3μL超纯水，10×PCR buffer2.5μL，1μL引物PSL-F(20μmol/L)，1μL引物PSL-R(20μmol/L)，(10mmol/L)dNTP 1μL，模板1μL，空白对照加1μL超纯水代替模板，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.2μL。其中，上述反应条件可以是：94℃5min；94℃30S，58℃30S，72℃30S，35个循环；72℃8min。

进一步，还可以将本发明引物及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。

本发明根据黄瓜细菌性角斑病菌gap1基因序列设计引物，该引物特异性好，用于PCR检测灵敏性高。本发明检测方法准确性高、灵敏度高，其能够快速简单地判断样品是否有黄瓜细菌性角斑病菌，为黄瓜种子进出口安全提供了保证。

附图说明

图1：本发明检测方法对黄瓜细菌性角斑病菌检测的实验结果

所有参试的12株黄瓜细菌性角斑病菌均能扩增出单一的179bp的电泳条带。图1中M：Marker DL2000；1-10分别为来源于NCPPB菌种保藏中心的黄瓜细菌性角斑病菌，NCPPB编号分别为540，541，542，543，277，467，1425，1428，1096，1097；条带11及12为2株吉林分离物；13为空白对照。

图2是本发明检测方法的灵敏度实验结果。

图2中M：Marker DL2000，1-7分别为：7.5×10⁷、7.5×10⁶、7.5×10⁵、7.5×10⁴、7.5×10³、7.5×10²、7.5×10¹、7.5×10⁰cfu/mL，8：空白对照，结果显示7.5×10³cfu/mL以上浓度菌液均可观察到电泳条，空白对照无条带。经过换算，本检测方法最低检测限大约是7.5个细菌。

图3是本发明检测方法对黄瓜叶片的检测应用实验。

图3中M为Marker DL2000；1-3为NCPPB 540菌株及2个吉林分离菌株接种黄瓜叶片后提取DNA扩增条带；4为健康黄瓜植株叶片提取的DNA；5为空白对照。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1引物的设计与合成

根据黄瓜细菌性角斑病菌gap1基因序列，利用Primer Premier

5.0软件设计引物，引物序列为：

PSL-F(正向)：5′-GTTCGGCGACGCAATCAATG-3′

PSL-R(反向)：5′-GTTGACTTCTTCGGCGGTGG-3′

实施例2PCR扩增方法的建立

1、PCR反应体系