[发明专利]猪微卫星标记的复合扩增的方法及其专用引物

说明书

技术领域

本发明涉及猪微卫星标记的复合扩增的方法及其专用引物。

背景技术

微卫星(microsatellite)，一般指基因组中由短的重复单元(一般为1～6个碱基)组成的DNA串联重复序列。微卫星标记(microsatellite)，又称为短串联重复序列(simple tandem repeats，STRs)或简单重复序列(simple sequence repeats)，是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由2～6个核苷酸的串联重复片段构成，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度变异性并且数量丰富，因此微卫星标记的应用非常广泛。

微卫星标记在目前应用极为广泛，具有以下显著特点：1)在高等动物的基因组内存在广泛的分布，据文献报道大约每间隔10-50kb就存在着一个微卫星标记；2)遗传稳定，符合孟德尔遗传定律，多态性高，信息含量丰富，许多微卫星位点都具有5个以上的等位基因；3)呈共显性遗传，易于区分纯合型和杂合型；4)通过PCR扩增和电泳分型，可以直接获得个体基因型，检测所需检材量少，灵敏度成功率高；5)大部分微卫星标记是位于基因组非编码区内的，不受自然和人工选择的影响，是一种中性标记。因此，在人类法医学鉴定、动物系谱分析和个体及亲缘关系鉴定、分析群体的遗传结构及群体间的遗传距离、监测育种和遗传操作效应、构建基因图谱、寻找与动物各个性状位点连锁的分组遗传标记等方面，微卫星标记具有重要的作用。

微卫星标记的检测包括DNA的提取、PCR扩增和基因型分型三个步骤。针对亲子鉴定、个体鉴定、遗传变异分析、系谱鉴定及育种选择等情况，通常需要对多个微卫星位点进行扩增和检测以达到所要求的精确度，这样实验成本高昂、费时长、工作量大。借助复合扩增技术(mutiplex PCR)能显著提高检测效率并极大的降低实验成本。其原理是，在同一个反应试管或者反应体系中加入多对引物，同时扩增检测多个目标序列，从而大大的减少了多次单独PCR扩增和检测的费用，缩短了实验时间、成本，提高了检测效率。然而，为了保证多个目的片段同时在一个PCR反应体系中特异性扩增，引物组合的选择以及反应条件的优化就格外重要了。这就需要多次反复的实验来摸索了。

微卫星的不同等位基因往往只是相差2到5个碱基，因此就需要高分辨率的电泳来区分。分型方法最早是采用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合放射自显影或者硝酸银染色来进行的，这种方法操作复杂且分型的条带不易读取，准确率差；自上世纪末以来，荧光标记的聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光标记毛细管电泳逐渐兴起并替代传统方法，其操作方便、准确率也大大提高。针对多个位点，采用不同颜色的荧光标记引物，利用基于荧光扫描技术的遗传分析仪，结合分子量标准自动计算等位基因大小，能够实现高通量和半自动化的微卫星分型。

目前，微卫星标记检测试剂盒在一些物种上已经商业化了，如人亲子鉴定的检测试剂盒、牛的微卫星标记检测试剂盒等等；但在猪上面并没有出现。我国是世界上养猪生产和猪肉消费第一大国，近年来，随着人们对亲子鉴定技术的了解越来越多，许多民事和刑事案件中与猪相关的亲权鉴定和个体识别检验要求也越来越多，另外养猪业也是我国畜牧业和农村支柱产业的重要组成部分，在猪遗传育种方面，国内还相对薄弱；利用微卫星标记检测对猪的亲子鉴定、育种及生产有重大的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于猪微卫星标记的复合扩增的引物组合物。

本发明提供的引物组合物由引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9和引物对10组成；其中，

引物对1由序列表中序列1所示的DNA和序列表中序列2所示的DNA组成；引物对2由序列表中序列3所示的DNA和序列表中序列4所示的DNA组成；引物对3由序列表中序列5所示的DNA和序列表中序列6所示的DNA组成；引物对4由序列表中序列7所示的DNA和序列表中序列8所示的DNA组成；引物对5由序列表中序列9所示的DNA和序列表中序列10所示的DNA组成；引物对6由序列表中序列11所示的DNA和序列表中序列12所示的DNA组成；引物对7由序列表中序列13所示的DNA和序列表中序列14所示的DNA组成；引物对8由序列表中序列15所示的DNA和序列表中序列16所示的DNA组成；引物对9由序列表中序列17所示的DNA和序列表中序列18所示的DNA组成；引物对10由序列表中序列19所示的DNA和序列表中序列20所示的DNA组成。

上述引物组合物中，每对引物对中的两条引物之间的摩尔比为1∶1。