[发明专利]MBD2-mTEM8融合的DNA疫苗及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及构建一种融合DNA疫苗，尤其涉及一种MBD2-mTEM8融合的DNA疫苗及其制备方法与应用。

背景技术

目前，抗肿瘤血管生成成为抗肿瘤治疗的一种有效手段，以激活细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)为主的主动免疫治疗策略在恶性肿瘤的综合治疗占有重要的地位，以激发主动免疫的DNA疫苗是近年来成为研究最多的疫苗形式，由于其易于扩增和修饰诸多优点越来越受到人们的重视。DNA疫苗又称核酸疫苗或基因疫苗，是编码免疫原或与免疫原相关的真核表达质粒DNA(有时也可是RNA)，它可经一定途径进入动物体内，被宿主细胞摄取后转录和翻译表达出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激机体产生非特异性和特异性2种免疫应答反应，从而起到免疫保护作用。目前，肿瘤DNA疫苗可以采用融合疫苗形式增强抗原呈递，采用联合及靶向疫苗不仅可以增强抗原呈递，还可以扩大免疫效应。融合疫苗，通常是利用其中一个分子与免疫识别或免疫应答密切相关，使之具有靶向呈递作用，以促进免疫抗原呈递，融合疫苗在抗原靶向呈递上具有更强的优势。

肿瘤血管内皮标志物8(TEM8)因其在肿瘤中特异性表达，成为抗肿瘤血管生成的新型候选靶标之一，过去的实验研究表明TEM8所构成的单独的分子疫苗免疫原性较低，而与其他抗原结合以后可以有效的激发免疫反应，后来的学者在临床上引入DC疫苗后可以有效的提高TEM8的免疫原性，抗瘤效果明显。小鼠防御素-beta2(MBD2)能够有效趋化iDC，本研究中我们设计了一个MBD2与鼠的TEM8构建成融合疫苗pMBD2-mTEM8疫苗，免疫荷有CT-26的Balb/C小鼠，能够有效的打破机体的免疫耐受，诱发机体产生针对肿瘤血管内皮细胞的免疫反应。

发明内容

本发明的目的在于是提供一种MBD2-mTEM8融合的DNA疫苗，所述疫苗包含MBD2基因、mTEM8基因，所述MBD2基因和mTEM8基因连接于pcDNA3.1载体上。

本发明的第二个目的在于是提供一种MBD2-mTEM8融合的DNA疫苗的制备方法，其包含以下步骤：

1)获取MBD2基因、mTEM8基因；

2)将步骤1)所述MBD2基因、mTEM8基因通过SEQ ID NO：5所示的连接肽连接，形成MBD2-mTEM8融合基因；

3)将步骤2)所述MBD2-mTEM8融合基因连接到pcDNA3.1载体上，形成所述DNA融合疫苗。

本发明的第三个目的在于是提供一种MBD2-mTEM8融合蛋白表达载体，其包含MBD2基因、mTEM8基因，所述MBD2基因和mTEM8基因连接于pcDNA3.1载体上。

所述的MBD2-mTEM8融合蛋白表达载体，MBD2基因的序列如SEQ IDNO：1所示，mTEM8基因的序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明的第四个目的是提供一种MBD2-mTEM8融合蛋白表达载体的制备方法，其包含以下步骤：

1)获取MBD2基因、mTEM8基因；

2)将步骤1)所述MBD2基因、mTEM8基因通过SEQ ID NO：5所示的连接肽连接，形成MBD2-mTEM8融合基因；

3)将步骤2)所述MBD2-mTEM8融合基因连接到pcDNA3.1载体上，形成所述融合蛋白表达载体。

所述的制备方法中步骤1)所述MBD2基因的序列如SEQ ID NO：1所示，mTEM8基因的序列如SEQ ID NO：4所示。

所述的制备方法中所述MBD2基因通过化学合成，所述mTEM8基因通过SEQ ID NO：2-3所示的引物从murine cDNA library通过PCR扩增获得。

所述的制备方法中步骤2)所述MBD2-mTEM8融合基因的序列如SEQ IDNO：8所示。

本发明的第五个目的是提供一种MBD2-mTEM8融合蛋白表达载体在制备DNA融合疫苗中的应用。

本发明的第六个目的是提供一种DNA融合疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明提供所述MBD2-mTEM8融合的DNA融合疫苗，能够有效的打破机体对mTEM8的免疫耐受，诱发机体产生针对血管内皮细胞的细胞免疫反应，并产生免疫记忆。本发明所述疫苗制备方法简单，且该融合DNA疫苗比传统疫苗安全，具有明显的抑制肿瘤生长的效果。本发明所述疫苗对研究其抗肿瘤血管生成的作用机制有着深刻的意义。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。