[发明专利]一种CD133高表达鼠肝肿瘤细胞系及制备方法有效
| 申请号： | 201110056613.3 | 申请日： | 2011-03-09 |
| 公开（公告）号： | CN102181399A | 公开（公告）日： | 2011-09-14 |
| 发明（设计）人： | 刘永忠;杨兆娟;马爱辉;张力;刘兰兰 | 申请（专利权）人： | 上海市肿瘤研究所 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N5/073;C12N7/00;C12R1/91 |
| 代理公司： | 上海天翔知识产权代理有限公司 31224 | 代理人： | 吕伴 |
| 地址： | 200032 上海*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 cd133 表达 肿瘤 细胞系 制备 方法 | ||
1.一种高表达CD133的鼠肝肿瘤细胞系，其特征在于，该细胞系为一种具有干细胞标志物CD133高表达量特性的鼠肝肿瘤细胞系。
2.根据权利要求1所述的一种高表达CD133的鼠肝肿瘤细胞系，其特征在于，所述细胞系于2010年12月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC No.C2010115。
3.根据权利要求1所述的一种高表达CD133的鼠肝肿瘤细胞系，其特征在于，其建立过程具体包含如下步骤：
a)分离p53-/-小鼠胚胎肝细胞(LPC细胞)：取E13.5d的p53-/-小鼠胚胎，在PBS中漂洗2-3次；用无菌眼科剪及镊子完整剪取其肝脏。将其剪碎后，加入肝脏消化液于37℃消化30min成单细胞悬液。离心去上清，用PBS洗2-3次，将细胞与大鼠抗小鼠E-cadherin单抗一起4℃孵育30min(所用抗体量为4ug E-cadherin/1×107个细胞)。用PBS洗2-3次，离心去上清，将细胞与羊抗大鼠的磁珠(20ul/l×108细胞)一起4℃孵育15min。最后采用磁珠分选系统(MACS)分离出E-cadherin+胚胎肝细胞。分离出的细胞接种于预先铺有明胶的细胞培养皿中，采用含10％胎牛血清、0.01M尼古丁、10-7mol/L地塞米松、1×ITS、1×巯基乙醇、40ng/ml的HGF、20ng/ml的EGF、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的DMEM/F12培养液，于37℃、5％二氧化碳/95％空气的恒温培养箱中进行培养。
b)MSCV-IRES-GFP-Hras(MIG-Hras)逆转录病毒的制备：按照invitrogen公司lipofectAMINETM2000 Reagent说明书提供的参考方法进行操作，将MIG-Hras质粒转染包装细胞Ecotropic中，培养48及72h后分别收集病毒上清。
c)LPC-H鼠肝肿瘤细胞系的建立：感染LPC细胞前一天，将LPC细胞接种于预先铺有明胶的24孔板中(5×103个细胞/孔)。感染时去培养液，加入b)中的病毒上清，每隔8h更换一次病毒上清，持续感染24h。去病毒，加入新鲜细胞培养液，隔天换液，每三天传代一次。收集1×105～1×107的细胞通过流式分选带GFP荧光的细胞，于新鲜细胞培养液中扩大培养。
d)含高比率CD133+细胞亚群并具有高致瘤性的鼠肝肿瘤细胞系的建立：将LPC-H鼠肝肿瘤细胞系培养至对数生长期，用0.25％胰酶+0.1％EDTA消化后，PBS洗涤两次，取1×105～1×107的细胞放入流式管中，离心去上清，加入100μl的10％山羊血清悬浮细胞，4℃封闭10min。随后加入带PE荧光的小鼠CD133抗体2.5ul(0.5mg/ml)，4℃孵育30min。用FACS缓冲液(PBS+0.5％BSA)洗涤两次，弃上清，加入1ml细胞培养液，通过流式分选仪将单个带GFP荧光、CD133+的LPC-H细胞打入加有新鲜细胞培养液的96孔板中。于37℃、5％二氧化碳/95％空气的恒温培养箱中进行培养。7-14d后，待各单个细胞扩增起来后，移入24孔板中继续培养。待细胞生长至生长对数期，各单克隆取一部分细胞进行CD133表达的检测，筛选得到高表达肿瘤干细胞标志物CD133的鼠肝肿瘤细胞系LPC-H12。
4.根据权利要求1所述的一种高表达CD133的鼠肝肿瘤细胞系，其特征在于，所述细胞系为一种对干细胞标志物CD133及EpCAM的表达量均高于初始细胞系LPC-H的鼠肝肿瘤细胞系。
5.根据权利要求1所述的一种高表达CD133的鼠肝肿瘤细胞系，其特征在于，所述细胞系为一种表达与干细胞相关的基因Alb、AFP、CK19、Bmi1、ALDH1a1、SOX1、Nanog、Notch1中的一种或多种的鼠肝肿瘤细胞系。
6.根据权利要求1所述，一种高表达CD133的鼠肝肿瘤细胞系，其特征在于，所述细胞系为一种较之初始细胞系LPC-H，具有体外高成球能力的鼠肝肿瘤细胞系。
7.根据权利要求1所述的一种高表达CD133的鼠肝肿瘤细胞系，其特征在于，所述细胞系为一种较之初始细胞系LPC-H，具有体内高致瘤能力的鼠肝肿瘤细胞系。
8.一种高表达CD133的鼠肝肿瘤细胞系的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：
a)分离p53-/-小鼠胚胎肝细胞(LPC细胞)：取E13.5d的p53-/-小鼠胚胎，在PBS中漂洗2-3次；用无菌眼科剪及镊子完整剪取其肝脏。将其剪碎后，加入肝脏消化液于37℃消化30min成单细胞悬液。离心去上清，用PBS洗2-3次，将细胞与大鼠抗小鼠E-cadherin单抗一起4℃孵育30min(所用抗体量为4ug E-cadherin/1×107个细胞)。用PBS洗2-3次，离心去上清，将细胞与羊抗大鼠的磁珠(20ul/l×108细胞)一起4℃孵育15min。最后采用磁珠分选系统(MACS)分离出E-cadherin+胚胎肝细胞。分离出的细胞接种于预先铺有明胶的细胞培养皿中，采用含10％胎牛血清、0.01M尼古丁、10-7mol/L地塞米松、1×ITS、1×巯基乙醇、40ng/ml的HGF、20ng/ml的EGF、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的DMEM/F12培养液，于37℃、5％二氧化碳/95％空气的恒温培养箱中进行培养。
b)MSCV-IRES-GFP-Hras(MIG-Hras)逆转录病毒的制备：按照invitrogen公司lipofectAMINETM2000 Reagent说明书提供的参考方法进行操作，将MIG-Hras质粒转染包装细胞Ecotropic中，培养48及72h后分别收集病毒上清。
c)LPC-H鼠肝肿瘤细胞系的建立：感染LPC细胞前一天，将LPC细胞接种于预先铺有明胶的24孔板中(5×103个细胞/孔)。感染时去培养液，加入b)中的病毒上清，每隔8h更换一次病毒上清，持续感染24h。去病毒，加入新鲜细胞培养液，隔天换液，每三天传代一次。收集1×105～1×107的细胞通过流式分选带GFP荧光的细胞，于新鲜细胞培养液中扩大培养。
d)含高比率CD133+细胞亚群并具有高致瘤性的鼠肝肿瘤细胞系的建立：将LPC-H鼠肝肿瘤细胞系培养至对数生长期，用0.25％胰酶+0.1％EDTA消化后，PBS洗涤两次，取1×105～1×107的细胞放入流式管中，离心去上清，加入100μl的10％山羊血清悬浮细胞，4℃封闭10min。随后加入带PE荧光的小鼠CD133抗体2.5ul(0.5mg/ml)，4℃孵育30min。用FACS缓冲液(PBS+0.5％BSA)洗涤两次，弃上清，加入1ml细胞培养液，通过流式分选仪将单个带GFP荧光、CD133+的LPC-H细胞打入加有新鲜细胞培养液的96孔板中。于37℃、5％二氧化碳/95％空气的恒温培养箱中进行培养。7-14d后，待各单个细胞扩增起来后，移入24孔板中继续培养。待细胞生长至生长对数期，各单克隆取一部分细胞进行CD133表达的检测，筛选得到高表达肿瘤干细胞标志物CD133的鼠肝肿瘤细胞系LPC-H12。
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