[发明专利]一种提高植物耐铝能力的载体及构建方法

权利要求书

1.一种用于提高植物耐铝毒能力的载体，其特征在于：是具有光诱导启动子和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的植物表达载体。

2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因来源于嗜热蓝藻。

3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于：所述的来源于嗜热蓝藻的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是野生型PEPC的一个突变体。

4.根据权利要求1或2或3所述的载体，其特征在于：所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的上游为Rubisco小亚基的光诱导型启动子。

5.根据权利要求1或2或3所述的载体，其特征在于：所述载体中用于构建所属植物表达载体的起始载体为pH2GW7。

6.一种用于提高植物耐铝毒能力的载体的构建方法，其特征在于包括下列技术方案：

（1）从GenBank中查找嗜热蓝藻PEPC的全长基因序列，并设计序列如下的一对引物：

    pepc5：5’- CACCGCATGCCATCAGTCCTCGATGTGACC-3’

    pepc3：5’- GATATCTTAGCCTGTATTGCGCATCCCCGC-3’

5’端引物pepc5，末端加CACC特征序列，并由此形成NcoI酶切位点；3’端引物pepc3，末端加XhoI酶切位点；以本申请人构建的一个入门质粒载体pENTR^TM2B-KsPEPC为模板扩增得到PEPC突变体的全长编码区的DNA片段；

（2）回收并纯化PEPC全长基因片段，并将其连接到pUCm-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pUCm-PEPC；

（3）构建入门载体pENTR*-PrbcS-PEPC，用NcoⅠ和XhoⅠ切割pENTR*-PrbcS-*T-GFP和pUCm-PEPC，回收载体pENTR*-PrbcS片段和PEPC基因cDNA片段，然后连接、转化、抽提质粒进行PCR检测和酶切检测，获得重组质粒pENTR*-PrbcS-PEPC；

（4）构建植物表达载体pH2-35S-PrbcS-PEPC，通过Gateway技术的LR反应把PrbcS-PEPC亚克隆到植物表达载体pH2GW7中，获得PEPC基因的植物表达载体pH2-35S-PrbcS-PEPC。