[发明专利]一种制备与β-内酰胺类抗生素结合的青霉素结合蛋白的方法及专用重组菌

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备与β-内酰胺类抗生素结合的青霉素结合蛋白的方法及专用重组菌。

背景技术

食品中残留的抗生素会破坏胃肠道菌群平衡，并可导致长期的腹泻、维生素缺乏及影响其他药物的疗效，从而影响人体健康。当前抗生素的残留问题已经引起人们的广泛关注，作为人们生活中的必需品，牛奶中的抗生素残留问题更是日益受到关注。如何确保牛奶质量安全，除了严格控制产业链中抗生素的使用外，建立牛奶中抗生素的快速检测方法则显得尤为重要。

牛奶中的抗生素残留主要来源于奶牛的饲料以及奶牛的疾病治疗，其中奶牛主要的疾病是乳腺炎，而治疗乳腺炎最常用的药物是β-内酰胺类抗生素。目前牛奶中β-内酰胺类抗生素的检测方法主要有仪器法(包括高效气相色谱、高效液相色谱以及色质联用技术等)、微生物法、免疫分析方法以及受体分析方法等。这些方法各有特点：仪器法准确、可靠、灵敏度高，是一种确证方法，但是不适合现场快速检测；微生物法可同时检测多种抗生素，但灵敏度不高、检测时间长，且无法定量；免疫分析方法基于抗原抗体的特异结合，具有灵敏度高、特异性强、可定量检测等优势，但由于灵敏度高且可识别同一类药物的抗体难以获得，制约了其在抗生素检测领域的应用；受体方法基于受体配体间的特异识别，在国外早有研究，且有产品问世(包括比利时UniSensor、美国Charm等)，但国内鲜有研究。欧盟制定了β-内酰胺类抗生素在牛奶中的最高残留限量：青霉素、氨苄西林、阿莫西林为4ppb；苯唑西林、邻氯西林、双氯西林、新青霉素III为30ppb；头孢喹肟20ppb；头孢噻呋、头孢氨苄100ppb；头孢唑啉、头孢哌酮50ppb。

青霉素结合蛋白(Penicillin-Binding Protein，PBP)是广泛存在于细菌表面的一种膜蛋白，是β-内酞胺类抗生素的主要作用靶位。但是目前制备青霉素结合蛋白的效率不高。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种重组菌。

本发明所提供的重组菌，按照包括如下步骤的方法制备得到：向出发大肠杆菌中导入青霉素结合蛋白的编码基因，得到重组大肠杆菌。

上述重组菌中，所述青霉素结合蛋白的编码基因是通过重组表达载体导入的；所述重组表达载体为向出发载体pET28b的多克隆位点间插入所述青霉素结合蛋白的编码基因得到的。

上述任一所述重组菌中，所述青霉素结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述任一所述重组菌中，所述出发大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)，所述青霉素结合蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

上述任一所述重组菌具体可为如下重组菌：重组菌，其名称为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)pET28b-PBP2x，其保藏编号为CGMCC No.4629。

本发明的另一个目的是提供一种制备SEQ ID NO：1所示蛋白的方法。

本发明所提供的种制备SEQ ID NO：1所示蛋白的方法，包括如下步骤：发酵上述任一所述重组菌，得到SEQ ID NO：1所示蛋白。

上述方法中，所述发酵中包括如下用IPTG进行诱导的步骤：在所述发酵的体系的A₆₀₀为0.6时，向所述发酵的体系中加入IPTG，使IPTG在所述发酵的体系中的浓度为ImM。

上述任一所述方法中，所述诱导的方法包括如下步骤：所述发酵的温度为37℃，所述发酵中使用的培养基按照如下方法制备得到：向LB液体培养基中添加卡那霉素，使卡那霉素在LB液体培养基中的浓度为30ug/mL，得到的混合溶液为所述培养基。

上述任一所述方法中，在所述发酵后，包括如下提取步骤：取发酵后的重组菌菌体，将其破碎，取上清液。

上述任一所述方法中，在所述提取后，包括如下纯化步骤：将所述上清液进行镍柱亲和层析，收集洗脱液；所述镍柱亲和层析中，使用的洗脱缓冲液按照如下方法制备得到：将20mmol Tris、0.5mol NaCl、500mmol咪唑用水溶解，用HCl调PH值至8.0，再用水定容至1L，得到1升洗脱缓冲液。

实验证明，本发明制备青霉素结合蛋白的方法得率高，解决了现有技术中得率不高、制备困难的问题。因此，本发明方法具有重要意义。

附图说明

图1为PBP 2x基因PCR琼脂糖电泳图。

图2为PBP 2x基因与pET28b载体连接后酶切鉴定图。

图3为IPTG诱导后不同时间点全蛋白SDS-PAGE图。

图4为PBP 2x蛋白纯化SDS-PAGE图。