[发明专利]根癌农杆菌介导的花生高效转基因方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物转基因技术，尤其涉及一种基于根癌农杆菌介导的花生转基因方法。

背景技术

花生是世界上最重要的油料作物之一。迄今所建立的花生转基因技术大多需要植株组培再生的程序，因而表现出较强的基因型依赖性且转化率较低。有重要经济价值的亲本材料未必容易转化。缺少一套通用性强的转基因技术，已经成为制约花生分子生物学基础研究和育种应用研究的瓶颈。

国际半干旱热带作物研究所(ICRISAT)通过PCR直接筛选，获得了无选择标记的转基因花生，西班牙型品种JL24转化率在75％以上，但仍需要组织培养的步骤。广东省农科院作物所梁炫强团队，报道了以珍珠豆型品种粤油7号带子叶的胚轴为外植体、由根癌农杆菌介导的花生高效转化体系，采用该体系可显著提高遗传转化率，gus基因阳性表达率高达73.3％，但该技术仍需要组培步骤，外源基因整合与转录的分子验证工作未见报道。我们申报了花器注射获得转基因花生的发明专利(专利申请号：201010182543.1)，该方法转化率高，且无需组培再生步骤，但容易获得外源基因多拷贝整合的花生转化体，不适用于农杆菌介导的遗传转化。

无论从花生遗传改良的角度，从花生作为植物生物反应器生产有用产品或作为基因功能分析工具的角度，还是从通过插入突变分离重要功能基因的角度考虑，都有必要建立一套农杆菌介导的、高转化率、基因型依赖性小或无基因型依赖性、简便易行的花生转基因技术。

发明内容

本发明的技术效果能够克服上述缺陷，提供一种根癌农杆菌介导的花生高效转基因方法，其弥补现行花生转基因技术转化率普遍偏低、基因型依赖性强、操作繁琐的不足。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：其包括如下步骤：

(1)使用常规方法将已构建好的携带目的基因的Ti质粒载体转入根癌农杆菌；

(2)转化菌体在YEP培养基中振荡培养；

(3)取2-6μl重悬的菌液，在花生生长的适宜期注入花生植株，使农杆菌在花生植株内侵染、转化；

(4)收获种子后，取花生子叶组织薄片，快速提取待测样品DNA作为PCR模板；

(5)使用依据目的基因序列设计的特异性引物进行PCR鉴定，电泳检测结果。

本发明的技术是在花生植株生长的适宜时期，利用器械造成损伤，使农杆菌得以进入，侵染、转化，无需经过组培再生阶段，获得转基因后代。

转化菌体在YEP培养基中的培养温度为25℃-30℃。振荡培养至OD₆₀₀值在0.1-0.6为止。花生生长的适宜期为花生播种后30-60天。菌液注入花生植株的位置为花生植株的地上部分。如转移NPT II基因，其特异性引物可采用WNPT-2F和WNPT-2R，其中引物WNPT-2F的序列(5’→3’，下同)为ATGACTGGGCACAACAGACAA，引物WNPT-2R的序列为GCAAGGTGAGATGACAGGAGA。

本发明通过根癌农杆菌介导的转基因技术，可方便快速获得可育后代，无需单独的组培再生阶段。

附图说明

图1为PCR检测转基因材料，采用NPT II基因特异性引物WNPT-2F和WNPT-2R(M：DL2000；P：阳性对照；N：阴性对照)；

图2为RT-PCR检测鉴定PCR阳性转基因材料(M：DL2000；P：阳性对照；N：阴性对照)。

具体实施方式

本发明的具体应用方法其包括如下步骤：

(1)使用常规方法将已构建好的携带目的基因的Ti质粒载体转入根癌农杆菌；

(2)转化菌体在YEP培养基中25℃-30℃振荡培养至OD₆₀₀值在0.1-0.6为止；

(3)取2-6μl重悬的菌液，在花生播种后30-60天注入花生植株的地上部分，使农杆菌在花生植株内侵染、转化；

(4)收获种子后，取花生子叶组织薄片，快速提取待测样品DNA作为PCR模板；(参见“花生健康组织和病组织简便快速DNA提取方法”，专利申请号：200910255786.0)

(5)使用依据目的基因序列设计的特异性引物进行PCR鉴定，电泳检测结果。