[发明专利]用于结核杆菌培养滤液蛋白10(CFP-10)定量检测的标准品研制

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和蛋白质工程领域，特别是涉及两种利用基因工程技术生产的链亲和素/结核杆菌培养滤液蛋白10融合蛋白。

背景技术

结核杆菌培养滤液蛋白10(Culture Filtrate Protein 10，CFP10)为结核分枝杆菌所特有，非致病分枝杆菌和卡介苗(BCG)则缺乏这种蛋白。许多研究表明CFP10蛋白是免疫优势抗原，具有很强的细胞免疫活性，能激活T细胞并刺激记忆T细胞的产生。CFP10经常出现在结核病人中，但不出现在已感染非致病分枝杆菌或接种BCG的健康人中，检测CFP10可以避免因非致病分枝杆菌感染或接种卡介苗而出现假阳性问题。因此，CFP10已成为诊断结核病的一个重要分子靶标。

链亲和素(SA)是由亲和素链霉菌产生的非糖基化同源四聚体蛋白，可结合四个生物素。它能与生物素非共价紧密结合(Kd＝10^-15M)，其结合力是抗原—抗体间作用力的一千至一百万倍。由于链亲和素可与生物素快速且几乎不可逆的强力结合，以及生物素较容易参入各种生物分子(如蛋白质，核酸和脂多糖)中，即生物素化，故链亲和素—生物素间的强力作用早已用于生物医学的许多领域(Sano，T.and Cantor，C.R.Streptavidin-containing chimeric proteins：design and production.Methods Enzymol.2000；326：305-311.)。利用基因工程技术，现已表达出许多含链亲和素的融合蛋白；链亲和素不会影响融合蛋白中另一肽段的活性，有的甚至还能增强其生物活性或/和稳定性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是研制时间分辨荧光免疫分析(time-resloved immunofluorometric assay，TRFIA)检测结核杆菌培养滤液蛋白10(CFP10)试剂盒的参考标准品。

本发明解决上述技术问题的技术方案是：

一种融合蛋白，该蛋白由接头肽连接1个链亲和素和1个结核杆菌培养滤液蛋白10构成，其中所述的接头肽的氨基酸序列为Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。

本发明融合蛋白可将链亲和素基因、结核杆菌培养滤液蛋白10基因以及接头DNA，通过基因重组、转化以及原核表达获得，其中基因重组、转化以及原核表达的方法均为本领域普通技术人员所熟识的技术。

为了便于融合蛋白的分离纯化，本发明融合蛋白SEQ NO.1的链亲和素的C端含6个组氨酸标签，本发明融合蛋白SEQ NO.2的链亲和素的N端含6组氨酸标签。

本发明还提供一种编码本发明融合蛋白的DNA序列，该DNA序列由成熟链亲和素cDNA、结核杆菌培养滤液蛋白10 cDNA通过TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGC GGG GGC GGA TCC连接而成。

将所述的编码本发明融合蛋白的DNA序列通过基因重组插入到原核表达载体中，然后转化大肠杆菌可获得高效表达本发明融合蛋白的工程菌。

本发明融合蛋白在上述工程菌中主要以包涵体的形式存在，从包涵体中分离纯化蛋白并复性处理后，即可获得本发明融合蛋白。

本发明链亲和素/结核杆菌培养滤液蛋白10(SA/CFP10)融合蛋白可作为研制时间分辨荧光免疫分析检测CFP10试剂盒的标准品。夹心ELISA检测研究表明：CFP10-SA融合蛋白的灵敏度是SA-CFP10融合蛋白的5倍以上，两者稳定性相当；而CFP10-SA的灵敏度则是CFP10的20倍以上，且有较好的稳定性。因此，CFP10-SA融合蛋白适合用作时间分辨荧光免疫分析检测CFP10试剂盒的标准品。

附图说明

图1是CFP10-L-SA-6His-pET24重组质粒的结构图。

图2是6His-SA-L-CFP10-pET24重组质粒的结构图。

图3是CFP10-L-SA-6His融合蛋白的表达SDS-PAGE电泳图，其中1是分子量标准(97.2、66.4、44.3、29、20、14.3KD)，2是工程菌诱导前，3是工程菌诱导后；4是破菌破上清，5是包涵体。

图4是CFP10-L-SA-6His融合蛋白的Ni-NTA柱层析纯化SDS-PAGE电泳图。其中1是分子量标准(97.2、66.4、44.3、29、20KD)，2是复性后还原(29.8KD)；3是复性后非还原。