[发明专利]一步法检测新型甲型H1N1 2009流感病毒的试剂制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种病毒检测试剂盒，尤其涉及一种pH1N1-2009流感病毒检测试剂盒。

背景技术

流感病毒属正黏病毒科，由8条单股负链RNA构成基因组。流感病毒根据核心蛋白(NP)及基质(M)的抗原性不同，可分为A、B、C三型，其中致病性最强、在世界上流行最广的是A型流感病毒。A型流感病毒根据表面糖蛋白凝血素(HA)的不同，可以分为15个亚型，H1-H15，根据表面糖蛋白神经氨酸酶(NA)的不同可以分为9个亚型N1-N9。

其中，H1N1流感病毒在变异过程中，不断突破种属界限，对人类生命健康带来严重威胁。1918-1919年欧洲流感大流行期间造成5000多万人死亡，病原为H1N1亚型流感病毒。1931年Shope首次从猪体内分离鉴定了H1N1亚型流感病毒。在1976年美国发生所谓的“新泽西”事件中，大约500人感染H1N1亚型流感病毒，该病毒与当时从猪体内分离到的病毒相同。2009年4月，首发于墨西哥，很快传播到美国既而在全球流行的流行性感冒是由新的甲型H1N1流感病毒引起。此次疫情导致过百人感染，导致了大量疫情其后传播到全世界，导致了人员的死亡和大量的经济损失。引起此次大规模流行的病毒较以往分离鉴定的病毒都发生了明显变异，传播速度异常迅速，带来全球性的恐慌。2009年6月2日，加拿大西部艾伯塔省一猪场的猪身上检测出甲型H1N1流感病毒，这是世界上首次发现有猪被这种新病毒感染。基因检测发现，这些猪身上的病毒与在墨西哥、美国以及其他国家发现的当前流行的这种病毒一致，这种新的甲型H1N1流感病毒又被称为pH1N1-2009流感病毒。

H1N1流感病毒具备跨群传播和群间传播两种传播方式。H1N1新型流感病毒原是一种于猪只中感染的疾病，属于甲型流感病毒。秋冬季属高发期，全年可传播。2009年墨西哥与美国爆发的猪流感疫情，即为H1N1病毒所引起的。2009年3至4月，墨西哥爆发H1N1疫潮，导致过百人感染，导致了大量疫情其后传播到全世界，导致了人员的死亡和大量的经济损失。

由于病毒发生了变异，以往的诊断技术对控制疾病传播没有任何意义，最有效的控制疫情扩大的方式是建立快速的诊断方法。目前最常用的快捷检测手段为实时荧光检测方法，因此建立一种实时荧光检测H1N1病毒的方法意义重大。由于H1N1病毒可直接感染人，导致人类患病或死亡，其公共卫生意义日渐显著。加强对H1N1病毒快速检测方法的研究，在减少世界经济损失和提高人类卫生健康方面，都具有深远的意义。

众所周知，基于时效性和准确性上的优势，实时荧光RT-PCR技术已经在疫病检测的很多项目上逐步取代了一般RT-PCR方法，成为疫病检测领域最常用的分子生物学方法，但是 到目前为止，我国尚未有同时鉴别检测pH1N1-2009流感病毒一步法RT-PCR快速检测方法研究和相关检测试剂的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测pH1N1-2009流感病毒的一步法荧光RT-PCR检测试剂盒。发明点在于所述试剂盒包括一对特异性引物以及一条荧光探针，通过该特异性引物、荧光探针与H1N1流感病毒RNA的特异性结合实现对pH1N1-2009流感病毒的快速鉴别检测。

本发明的另一目的是提供上述一步法荧光RT-PCR检测试剂盒的检测方法。

本发明的另一目的是提供上述一步法荧光RT-PCR检测试剂盒在鉴别检测pH1N1-2009流感病毒中的应用。

本发明提供的一步法荧光RT-PCR检测试剂盒的制备方法如下：

首先，合成特异性引物和荧光探针序列。

本发明选择pH1N1-2009流感病毒NA基因的保守序列片段为靶目标，针对pH1N1-2009流感病毒NA基因检测的扩增目标片段长度为121bp，该扩增目标片段的序列如序列表<400>4所示。根据pH1N1-2009流感病毒NA基因保守序列的特点，应用primer Express 3.0软件和DNAStar中的PrimerSeleCT软件设计待测引物序列；采用β-乙腈亚磷酸胺化学合成法，使用全自动DNA合成仪进行OligoDNA的合成待测引物和探针，同时在探针5’端标记荧光报告基团FAM(6-羧基荧光素)，3’端标记淬灭基团BHQ。

其次，筛选特异性引物和荧光探针序列。

将合成好的引物和探针分别通过特异性比较实验、灵敏度检测实验、重复性和准确度检测实验；最终确定各项性能较优的一对特异性引物和一条荧光探针，引物和探针序列为：