[发明专利]快速定量检测西瓜果斑病菌的蛋白芯片及其制备方法

权利要求书

1. 一种快速定量检测西瓜果斑病菌的蛋白芯片，其特征在于：是在芯片基片上固定至少一种西瓜果斑病菌捕获抗体的生物芯片。

2. 如权利要求1所述的快速定量检测西瓜果斑病菌的蛋白芯片，其特征在于：所述基片上还固定有酶标记的IgG抗体作为阳性对照、点样缓冲液作为阴性对照；所述基片为硝酸纤维素膜。

3. 如权利要求1或2所述的快速定量检测西瓜果斑病菌的蛋白芯片，其特征在于：所述酶标记的IgG是碱性磷酸酶标记的IgG，作为蛋白芯片质量控制的阳性对照固定于芯片基上。

4. 一种快速定量检测西瓜果斑病菌的蛋白芯片的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

a. 基片预处理：基片使用前需以ddH₂O浸泡，并晾干恒定；所述的浸泡时间至少15min，优选30min；所述的晾干温度为15-37°C，优选25°C；

b. 芯片的点样制备：以点样缓冲液稀释捕获抗体，同时取酶标记的IgG和点样缓冲液分别作为阳性对照，阴性对照，点样并固定；所述的点样缓冲液为0.001-0.5mol/L、pH值为7.0-10.0的碳酸盐缓冲液，优选0.05 mol/L，pH为9.6的碳酸盐缓冲液，碳酸盐缓冲液为Na₂CO₃ 1.59 g, NaHCO₃ 2.93 g, NaN₃ 0.2 g, ddH₂O 1000 mL；所述的捕获抗体浓度为20-80mg/L，优选80 mg/L；所述的点样体积为0.01-0.3uL，优选0.2 uL；所述的固定条件为15-37°C，干燥固定15-60min，优选37°C，20min。

5. 一种快速定量检测西瓜果斑病菌的蛋白芯片的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1) 绘制定量标准曲线：液体培养西瓜果斑病菌，无菌ddH₂O梯度稀释后，以平板计数法获取菌悬液浓度；将梯度菌悬液分别与蛋白芯片杂交，洗涤液洗涤后，加入检测抗体反应，再与相应显色底物反应，最后以ddH₂O洗涤终止显色；平板扫描仪获取芯片结果进行灰度分析，利用阳性对照点灰度值校正各芯片检测信号，绘制检测信号灰度值与菌液浓度间的散点图，拟合线性方程，得到定量测定标准曲线；

(2)检测实际样品：将待检植物样品研磨后与提取缓冲液配制样品液，蛋白芯片孵育杂交，再与检测抗体、相应显色底物分别反应，利用肉眼判定或扫描仪扫描分析灰度，将检测灰度值带入标准曲线方程，便可定量得出样品中目标菌量。

6. 如权利要求5所述的快速定量检测西瓜果斑病菌的蛋白芯片的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中检测抗体的稀释液为含0.01-2.0% BSA和0.01-2.0%吐温-20的磷酸盐缓冲液；所述洗涤液为含0.01-2.0%吐温-20的磷酸盐缓冲液；所述显色底物为，与碱性磷酸酶相对应的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/四唑硝基蓝(BCIP/NBT)显色底物。

7.如权利要求5所述的快速定量检测西瓜果斑病菌的蛋白芯片的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中检测抗体的稀释液为含0.2% BSA和0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液；所述洗涤液为含0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液。

8. 一种快速定量检测西瓜果斑病菌的蛋白芯片的试剂盒，其特征在于：包括有权利要求1至3所述的蛋白芯片；还包括有检测抗体原液，抗体稀释液，洗涤液和显色试剂：所述抗体稀释液为含0.01-2.0% BSA和0.01-2.0%吐温-20的磷酸盐缓冲液；所述洗涤液为含0.01-2.0%吐温-20的磷酸盐缓冲液；所述显色底物为，与碱性磷酸酶相对应的5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/四唑硝基蓝(BCIP/NBT)显色底物。