[发明专利]一种表达小反刍兽疫病毒H基因的活载体疫苗及制备方法

说明书

技术领域

本发明提供一种表达小反刍兽疫病毒H基因的活载体疫苗，同时还公开了其制备方法，用于预防小反刍兽疫的发生和流行，属于生物工程技术领域。

背景技术

小反刍兽疫（Peste des Petits Ruminants，PPR）是由小反刍兽疫病毒（Peste des Petits Ruminants virus，PPRV）引起的小反刍动物（特别是山羊和绵羊）的烈性，接触性传染病，小反刍兽疫作为一种病毒性疾病，还没有有效的药物进行治疗，该病主要依靠疫苗免疫进行预防。目前，世界上预防该病还是以传统的弱毒苗为主，但伴随着生命科学的迅速发展，在新型疫苗的研究方面已经取得了一定进展。基因疫苗、亚单位疫苗、重组疫苗、活载体疫苗等逐渐成为新型疫苗的代表。特别是病毒活载体疫苗，由于其只表达目的蛋白抗原，克服了弱毒疫苗毒力返祖及死苗灭活不确实的缺点，免疫效果确实，同时可以达到一次免疫预防多种疾病的作用，因此倍受研究人员青睐。

经检索未见以犬2型腺病毒为载体小反刍兽疫病毒H基因重组活载体疫苗的文献报道。

发明内容

本发明提供一种表达小反刍兽疫病毒H基因的活载体疫苗，具有良好的免疫保护效果，无毒副作用，制品容易保存，便于运输，保质期限长。

本发明还提供上述表达小反刍兽疫病毒H基因的活载体疫苗的制备方法，生产工艺简单，适合于工业化生产。

本发明提供的表达小反刍兽疫病毒H基因的活载体疫苗，其特征在于：以犬2型腺病毒为载体的重组小反刍兽疫病毒H基因的活载体疫苗。

本发明的技术解决方案如下：

1.小反刍兽疫病毒保护性抗原基因的克隆：通过RT-PCR方法获得小反刍兽疫保护性抗原H基因的全长基因；

2.重组质粒的构建：将目的基因克隆入含有CAV-2全基因组的载体质粒中，重组质粒缺失了病毒基因组部分E3区；

1）通过PCR方法将CAV-2全基因组克隆入质粒pPoly2中，获得含有CAV-2基因组双末端的拯救质粒pPoly2-UD，经BstB I + HindⅢ酶切线性化后与CAV-2基因组DNA进行同源重组，获得CAV-2全基因组克隆质粒pPoly2-CAV-2，其特征是含有CAV-2全基因组；

2）将经步骤1获得的小反刍兽疫病毒保护性抗原H基因经酶切及体外连接的方法克隆到真核表达载体pVAX中，获得真核表达质粒pVAX-H，其特征是含有目的基因表达盒，包括巨细胞病毒（CMV）启动子、目的基因和多聚A（polyA）结构；

3）将真核表达质粒pVAX-H与含有CAV-2基因组E3区片段的质粒pVAX-E3酶切后在体外连接，获得目的基因真核表达转移载体pVAX-ΔE3-H，其特征是所含CAV-2基因组E3区部分基因被缺失；

4）真核表达转移载体pVAX-ΔE3-H与CAV-2全基因组克隆质粒pPoly2-CAV-2经酶切连接后获得含有目的基因表达盒的重组质粒pCAV-2-H，其特征是含有质粒pPoly2部分片段及缺失部分E3区的CAV-2基因组，其中E3区缺失部分由目的基因表达盒代替；

5）重组病毒的获得：将重组质粒转染MDCK细胞，通过细胞生物合成系统复制、包装获得重组病毒；

6）疫苗的制备：将阳性重组病毒通过敏感细胞增殖后，加入保护剂制成冻干制品。

本发明所述表达小反刍兽疫病毒H基因的活载体疫苗的生产工艺，具体步骤如下：

1）PCR方法获得含有CAV-2基因组双末端的拯救质粒pPoly2-UD，经PstI + Hind III酶切线性化后与CAV-2基因组DNA进行同源重组，获得CAV-2全基因组克隆质粒pPoly2-CAV-2；

PCR引物：

P₁: 5^'  gcg-tgc-cta-act-aca-aac-tca-at

5^'  gcg-gcc-gcg-cct-gct-gct-tga-ttt-tgt-gat-c

P₂: 5^'  gcg-gcc-gca-ctc-ata-gaa-gta-ggc-agc-tcc-g

5^'  cgg-ccg-cat-cat-caa-taa-tat-aca-gga-caa-ag

2）用RNA提取试剂盒提取小反刍兽疫病毒基因组RNA；

3）RT-PCR方法获得H基因，片段长度为1830bp；