[发明专利]鸡白痢沙门氏菌减毒突变株△S6702(OmpR)及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种将野生型鸡白痢沙门氏菌毒力基因缺失的构建方法，特别涉及以OmpR基因作为靶基因，及一种用于基因缺失的引物设计、电转化方法及通过表达FLP重组酶的辅组质粒来消除抗性基因的方法，得到鸡白痢沙门氏菌减毒突变株△S6702(OmpR)，保藏号CGMCC NO:4376。

背景技术

鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌引起雏鸡和火鸡的一种败血性传染病。鸡白痢沙门氏菌多侵害20日龄以内幼雏，引起白色下痢，病死率极高，成年鸡则可带菌而无临床症状。该病既可垂直传播，又有严重的水平传播，所以造成的危害和经济损失巨大。

目前在现代医药中使用疫苗预防传染性疾病是最有效的措施，以疫苗接种预防鸡白痢的研究一直未曾间断过，但传统的灭活疫苗和亚单位苗免疫效果不佳，免疫途径不便而逐渐被活疫苗所取代。现代生物学和DNA重组技术以及对沙门氏菌毒力遗传学的深入研究和了解，为该病原体基因组中引入多重、限定、减毒和不能回复的突变提供了可能性，这种突变是制备减毒活疫苗的遗传学基础。近些年来，Red同源重组法作为一种新的基因打靶技术已经被广泛应用于大肠杆菌的基因敲除与基因替换，并应用于其他细菌及病毒的基因敲除。

已有学者采用转座子随机插入法鉴定出一些肠炎沙门氏菌与生物膜形成相关基因：ompR、spiA、steB(蛋白质类基因)、rpoS、metE、rfaG、rfbH、rhlE(酶类基因) （董红燕，张小荣，潘志明等，转座子随机插入鉴定肠炎沙门氏菌生物膜形成相关基因，2008， 微生物学报）；焦新安等报道减毒鸡沙门氏菌97A 疫苗显示出良好的安全性和免疫效果（焦新安，潘志明，倪振亚等，减毒鸡沙门氏菌安全性和免疫效力初步研究，1998，中国畜禽传染病），为评价ompR、spiA、metE、rfaG基因在鸡白痢沙门氏菌毒力中的作用，获得预防鸡白痢的减毒活疫苗候选株，我们分别构建了这4个基因缺失的减毒株。

发明内容

本发明的目的是提供1株鸡白痢沙门氏菌减毒突变株及其构建方法。

所说的鸡白痢沙门氏菌减毒突变株△S6702(OmpR)，是鸡白痢沙门氏菌（Salmonella pullorum）CGMCC NO:4376。

上述所说的鸡白痢沙门氏菌减毒突变株，是用Red同源重组法将鸡白痢沙门氏菌OmpR 基因敲除，获得预防鸡白痢的减毒活疫苗候选株△S6702(OmpR)。

具体的构建方法是：用一对带有50核苷酸（nt）左右同源臂的氯霉素抗性基因（Cm^R）经电转化导入鸡白痢沙门氏菌S6702 （CGMCC NO:4625）白痢沙门氏菌OmpR基因部分缺失并于其中插入Cm^R，获得抗氯霉素的转化子，再用表达FLP重组酶的辅组质粒电转入抗氯霉素转化子，将抗性基因消除，获得无抗性的突变株，命名为△S6702(OmpR)。以1日龄SPF鸡为模型，比较基因缺失突变株与野生株之间毒力的差异，致死率试验结果表明，△S6702(OmpR)突变株的毒力显著降低，是潜在的鸡白痢沙门氏菌减毒候选活疫苗。

本发明实现对野生型鸡白痢沙门氏菌菌株的减毒。为研制鸡白痢沙门氏菌减毒活疫苗及活载体疫苗奠定基础。

附图说明

图1.  fliC基因的PCR扩增产物及其RFLP图谱

M: 100bp DNA marker；1: 分菌株S6702 fliC基因的PCR扩增结果；2: 分菌株S6702Hin6Ⅰ酶切结果。

图2. S6702生物膜状态的扫描电镜观察。

图3是质粒pkD3的图谱。

图4是OmpR同源臂+氯霉素抗性基因打靶片段的PCR扩增结果

M :200 bp marker； 1: Red重组的片段。

图5是质粒pKD46的图谱。

图6是突变株的PCR鉴定

M 100 bp marker；1 野生株S6702的PCR扩增片段；2有cat基因突变株的PCR扩增片段；3无cat基因突变株的PCR扩增片段。