[发明专利]免疫抑制剂微生物菌株的复合诱变

说明书

技术领域

本发明涉及微生物菌株的诱变技术，具体涉及吸水链霉菌、筑波链霉菌、茄病镰刀菌和短密青霉菌四个菌株的选育诱变技术。

背景技术

免疫抑制剂是可以抑制免疫反应的药物，选择性免疫抑制剂对淋巴细胞有专一性，而对红细胞生成几乎没有影响或毒性极低，不损害宿主对细菌和真菌的感染防御机制。目前已广泛用于器官移植抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗。国外对免疫抑制剂的研究由来已久，自1954年人类第一例同卵双生子间肾脏移植手术取得成功后，医学家在器官移植方面的研究也取得了许多重大突破，近年来，国内外学者也正积极致力于新的免疫抑制剂的研究开发。发现了大批具有免疫抑制活性的微生物产物。微生物来源的免疫抑制剂是目前研究的热点，包括环孢菌素A、吗替麦考酚酯、他克莫司和雷帕霉素等新型免疫抑制剂。

环孢菌素A(CyclosporinA，CsA)，真菌茄病镰刀菌培养液中分离出来的一种含11个氨基酸的环形多肽。特异性对T细胞(主要是Th细胞)有较好的选择性抑制作用，对其他的免疫细胞的抑制作用较弱，临床用于抗器官移植排斥和自身免疫病的治疗。

吗替麦考酚酯(MycopHenolate Mofetil，MMF)是麦考酚酸(又名霉酚酸酯)的2-乙基酯类衍生物，从短密青霉中分离提取。在体内脱酯化后形成具有免疫抑制活性的代谢产物M P A，后者通过抑制鸟嘌呤的合成，选择性阻断T和B淋巴细胞的增殖，对移植排异和自身免疫性疾病均有显著疗效。临床上用于器官移植和自身免疫性疾病，且副作用少，显示了良好的应用前景。

他克莫司(Tacrolimus，FK-506)是Kino等从日本筑波山近郊土壤中分离出的筑波链霉菌产生的大环内酯类代谢产物，临床用于预防各种器官移植所出现的排斥反应，其药物疗效是环胞霉素A的10-100倍。

雷帕霉素(西罗莫司，Rapamycin，RPM)，Ayerster实验室于1975年在太平洋的Ester岛上发现的一种吸水链霉菌NRRL5491(ATCC 29253)所产生的一种亲脂性三烯含氮大环内酯类抗真菌抗生素，为35元环内酯化合物。对外周血单核细胞的有效抗增殖作用比环孢素A强50～500倍，肾毒性比环孢素和他克罗司低。1999年应用于临床，是一种疗效好、低毒、无肾毒性的新型免疫抑制剂。

这些新型免疫抑制剂可以通过大规模工业发酵的方法获得，能有效地降低药物成本，提高药物制剂的安全性，对促进器官移植的发展，提高患者的生命质量具有重要的意义。

良好的菌种是微生物发酵工业的基础。从自然界直接分离的菌种，一般而言其发酵活力往往是比较低的，不能达到工业生产的要求。因此，需要根据菌种的形态、生理特点来改变菌种。以微生物菌株的自然变异为基础的生产选种的几率并不高，因为这种变异率太小，仅为10^-6～10^-10。为加大其变异率，通常采用物理和化学因素促进其诱变，这种诱发突变为基础的育种就是诱变育种，他是国内外提高菌种产量、性能的主要手段。诱变育种是利用物理化学诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，促进其突变率显著提高，而后采用快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符号育种目的的突变株。

微生物常用的诱变方法主要为化学、物理以及复合诱变，其中化学诱变剂主要是烷化剂(如NTG(亚硝基呱)、EMS(甲基磺酸乙酯)、NMU(亚硝基甲基腮)、DES(硫酸二乙酯)、氮芥和环氧乙烷等)、简介类似物和吖啶类化合物；物理诱变物理诱变剂主要有紫外线，X-射线，γ-射线，快中子，激光，微波，离子束等。复合诱变包括两种或多种诱变剂的先后使用，同一种诱变剂的重复作用和两种或多种诱变剂的同时使用。复合诱变具有协同效应.如果两种或两种以上诱变剂合理搭配使用复合诱变较单一诱变效果好。

本发明采用复合诱变技术分别对吸水链霉菌、筑波链霉菌、茄病镰刀菌和短密青霉菌四个菌株进行诱变育种，诱变育种后的菌株可使环孢菌素A、吗替麦考酚酯、他克莫司和雷帕霉素的产量分别提高35～60％。

发明内容

本发明是通过复合诱变的技术方法，分别对吸水链霉菌、筑波链霉菌、茄病镰刀菌和短密青霉菌四个菌株进行诱变育种，使得诱变育种后的菌株可使环孢菌素A、吗替麦考酚酯、他克莫司和雷帕霉素的产量分别提高35～60％。

本发明中吸水链霉菌和筑波链霉菌的复合诱变方法是紫外线诱变、NTG诱变和离子注入复合诱变组合。