[发明专利]具持续降血糖和受体高结合的人胰岛素及类似物的偶联物

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地讲，本发明涉及人胰岛素及类似物的重组制备、修饰、纯化及其应用。

背景技术

胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质，含有51个氨基酸，分子量约5800，胰岛素分子有靠两个二硫键结合的A链(21个氨基酸)与B链(30个氨基酸)，如果二硫键被打开则失去活性。B细胞先合成一个大分子的前胰岛素原，以后加工成八十六肽的胰岛素原，再经水解成为胰岛素与连接肽。胰岛素的主要生理作用是调节代谢过程：1、促进组织细胞对葡萄糖的摄取和利用，促进糖原合成，抑制糖异生，降低血糖；2、促进脂肪酸合成和脂肪贮存，减少脂肪分解；3、促进氨基酸进入细胞，增加蛋白质合成速度。

糖尿病(DM，Diabetes Mellitus)是一种胰腺功能病变的代谢疾病，特点是慢性高血糖，伴随因胰岛素(Insulin)分泌或作用缺陷引起糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱，其主要特征是高血糖。主要分为两种病型：Ⅰ型(IDDM)，胰岛素绝对不足引起；Ⅱ型(NIDDM)，胰岛素相对不足引起。糖尿病已成为一种常见病、多发病，且成为继癌症、心脑血管病之后，第三大威胁人类生命的疾病。

胰岛素通过与体内细胞膜上胰岛素受体的相互作用，调节血糖维持在正常水平，是最有效的糖尿病治疗药物之一。胰岛素受体是一种四聚体的跨膜糖蛋白，由两个α亚基和两个β亚基通过二硫键连接。两个α亚基位于细胞质膜的外侧，有胰岛素结合位点；两个β亚基是跨膜蛋白，起信号转导作用。无胰岛素结合时，受体的酪氨酸蛋白激酶没有活性。当胰岛素与受体的α亚基结合时，改变β亚基的构型，酪氨酸蛋白激酶被激活，激活后催化两个反应：①使四聚体复合物中β亚基特异位点的酪氨酸残基磷酸化，即自我磷酸化；②磷酸化的酪氨酸残基IRSs结合并激活第二信使，放大、级联信号，引起代谢调节。胰岛素与受体结合的程度取决于受体数目与亲和力，此二者又受血浆胰岛素浓度调节。当胰岛素浓度增高时胰岛素受体数下降，即下降调节。肥胖的非胰岛素依赖型糖尿病人由于脂肪细胞膜上受体数下降，对胰岛素不敏感性，称胰岛素抵抗。经饮食控制、体育锻炼后体重减轻，脂肪细胞膜上胰岛素受体数增多，与胰岛素结合力加强而使血糖利用改善，调节血糖恢复到正常水平。

胰岛素与受体结合率越高，调节血糖的效果越明显，结合率的检测采用竞争结合试验法：受体与I¹²⁵-胰岛素一起孵育，在反应体系中加或不加饱和浓度的未标记的待测胰岛素(或胰岛素类似物)，放射性标记和未标记的待测胰岛素一起得到总的胰岛素结合量，单独加入放射性标记的I¹²⁵-胰岛素得到非特异性结合量。总结合量减去非特异性结合量得到胰岛素的特异性结合量，特异性结合量除以反应体系中胰岛素总浓度得到特异性结合率。竞争结合试验中的受体优选经过麦胚凝集素-琼脂糖凝胶柱(WGA)层析后得到的大鼠肝脏的胰岛素受体，原因是大鼠肝脏中胰岛素受体含量高，提取方便，且与胰岛素受体高度同源的胰岛素样生长因子-1受体在肝脏中的表达水平低，对检测干扰极小(马歇克等著 蛋白质纯化与鉴定实验指南.科学出版社，1999，P141-192；程宁莉等.新生小牛肝组织胰岛素受体的功能.上海第二医科大学学报，1997，12(2)：23-25；Sinha MK.Subunit structure，autophosphorylation，and tyrosine-specific protein kinase activity of hepatic insulin receptors in fetal，neonatal，and adult rats.Diabetes，1987；36(1)：1161)。