[发明专利]一种基于液相芯片的多靶点定量核酸检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种核酸检测方法，尤其涉及了一种基于液相芯片技术的多重寡核苷酸连接检测反应进行多靶点定量核酸检测的方法。此方法可用于样本基因型、DNA甲基化、拷贝数变异、染色体非整倍性异常和基因表达检测。

背景技术

1.基因分型

基因在染色体上的位置称为座位，每个基因都有自己特定的座位。凡是在同源染色体上占据相同座位的基因都称为等位基因。在自然群体中往往有一种占多数的(因此常被视为正常的)等位基因，称为野生型基因；同一座位上的其他等位基因一般都直接或间接地由野生型基因通过突变产生，由于DNA分子中的特点位点发生碱基对的增添、缺失或改变，而引起的基因结构的改变，相对于野生型基因，称它们为突变型基因。在二倍体的细胞或个体内有两个同源染色体，所以每一个座位上有两个等位基因。如果这两个等位基因是相同的，那么就这个基因座位来讲，这种细胞或个体称为纯合体；如果这两个等位基因是不同的，就称为杂合体。在杂合体中，两个不同的等位基因往往只表现一个基因的性状，这个基因称为显性基因，另一个基因则称为隐性基因。由于基因突变通常发生在DNA复制时期，即细胞分裂间期，包括有丝分裂间期和减数分裂间期；同时基因突变和脱氧核糖核酸的复制、DNA损伤修复、癌变和衰老都有关系，基因突变也是生物进化的重要因素之一，通过检测样本的基因型，实现基因分型，除了本身的理论意义以外，对科学研究和生产活动都有广泛的实际意义。

2.DNA甲基化

DNA甲基化是表遗传学上研究最深入的一种机制，是一种酶介导的化学修饰过程。DNA甲基化后核苷酸顺序未变，而基因表达受影响。DNA的甲基化对维持染色体的结构、X染色体的失活、基因印记以及许多人类基因病(如癌症，心血管疾病，糖尿病)发生发展都起重要的作用。

DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶(DNMT)的作用下，基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5′碳原子共价键结合一个甲基基团。CpG二核苷酸序列在基因组中出现的比例远低于基因组中其他二核苷酸序列。但是在基因组中有一些长度约0.5-4kb的区域，这些区域CpG密度很高，称其为CpG岛。56％基因的邻近启动子区域带有CpG岛。在正常的细胞中CpG岛通常是处于非甲基化状态。但是，在癌细胞中，肿瘤相关基因启动子的这些区域发生了超甲基化，这个现象被认为是肿瘤发生过程中最为重要的表观遗传学改变。启动子的甲基化在各个类型的肿瘤的发生中都有被发现，并且和转录水平的基因异常沉默有关。

有关基因启动子异常甲基化与肿瘤发生之间的关系的研究，目前主要集中在以下4类基因：抑癌基因(包括Rb、VHL、p16^INK4a、p15^INK4b、p14^ARF、p73、BRCA1、APC、FHIT、RARB22、RASSF1A)、DNA修复基因(MGMT和hMLH1)、肿瘤分子侵袭转移相关基因(E2cadherin、DAPK、TIMP3)及代谢酶基因(GSTP1)。这些基因涉及细胞间信号转导、细胞周期调控、凋亡、DNA损伤修复及肿瘤的侵袭转移等过程。几乎所有的人类肿瘤中都存在肿瘤相关基因的异常甲基化。

2001年M.Esteller等人对涵盖了肺癌，乳腺癌，结肠癌等15种癌症的600个肿瘤标本进行分析，发现12个重要的肿瘤相关基因的启动子在癌组织中发生了甲基化模式的改变[1]。结果显示，每一类型的肿瘤中都同时存在着多种肿瘤相关基因的异常甲基化，而且不同部位的肿瘤组织中，各种基因的甲基化发生频率是不同的，存在着明显的基因——肿瘤类型相关性。胃肠道肿瘤(如结肠癌、胃癌等)中p16^IN K4a、p14^ARF、MGMT、APC和hMLH1基因的甲基化比率较高；呼吸系统肿瘤(肺癌、头颈部癌)中p16^INK4a、DAPK、MGMT基因的甲基化较常见；乳腺癌、卵巢癌中p16^INK4a、GSTP1、BRCA1、CDH1等基因启动子异常甲基化较为频繁；而恶性血液系统疾病中基因异常甲基化的情况与其它实体瘤明显不同，这些肿瘤中p73、p15的异常甲基化频繁，这两种基因的异常甲基化在其他肿瘤中则很少见。肿瘤组织中这些基因的启动子超甲基化而关闭表达，从而导致了细胞中多个关键的调控通路发生功能紊乱。因此，显而易见的，研究肿瘤细胞异常的表观遗传谱和弄清遗传图谱一样，能够深化对于不同类型肿瘤的发生及发展过程的理解，并且能够用作鉴别肿瘤类型和亚型的辅助手段[2]。

3.拷贝数变异