[发明专利]检测维生素C二步发酵中细胞内代谢物变化的方法

权利要求书

1.一种检测维生素C二步发酵中细胞内代谢物变化的方法，包括下述步骤：

(1)对维生素C二步发酵中所用的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)和氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)细胞内的小分子代谢物进行测定：

①细胞收集及淬灭：

将所述巨大芽孢杆菌和氧化葡糖杆菌进行发酵，在发酵过程中选3-5个时间点，所述时间点位于所述发酵过程的前期、中期和后期，在所述时间点快速取出发酵液样品，离心，收集下层的细胞，并用磷酸盐缓冲液清洗，立即用液氮淬灭，终止代谢反应；用液氮研磨细胞以除去样品中大量的水分，并破碎细胞，获得3-5份破碎细胞；

②提取细胞内小分子代谢物：

取步骤①获得的3-5份破碎细胞20-100mg分别置于离心管中，加入0.5-2.0ml-40℃保存的体积浓度为50％的甲醇水溶液为提取液，并加入10μl-20μl的0.07-0.14mg/ml氘标记的丁二酸的水溶液为内标物，混匀；置于液氮中反复冻融2-4次，每次冻0.5-3.0min；离心收集上清得到A液；再次加入体积浓度为50％的甲醇水溶液为提取液0.5-2.0ml，混合均匀，离心收集上清，得到B液，将所述A液和B液混匀，并冷冻干燥；

③衍生化：

向步骤②获得的冻干的样品中加入40-60μl的20mg/ml甲氧基胺盐酸盐吡啶溶液，30-40℃水浴，进行肟化反应60-100min；再加入50-100μl的N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙酰胺，35-40℃水浴，进行硅烷化反应30-80min；

④用气相色谱-飞行时间质谱联用仪测定步骤③获得样品成分及相对含量：

将1μl步骤③获得样品进到气相色谱中，色谱柱为DB-5MS，所述色谱柱的规格为30m×0.25mm i.d.，进样口温度250℃-280℃，载气为高纯氦气，柱温箱升温程序为：初始50℃-80℃保持2min-5min，以4℃/min-8℃/min的速度升到260℃-300℃，保持3min-8min，使用EI电离源，源温230℃-260℃，检测器电压2300V-2700V，电离电压60eV-80eV，电流30μA-50μA；质谱检测范围50-800m/z；小分子代谢物的鉴定使用NIST数据库，质谱数据的处理和小分子代谢物相对含量的测定使用Masslynx 4.1软件；并通过对色谱峰面积积分处理，并与内标物的峰面积对照，得到维生素C二步发酵过程中细胞内各个小分子代谢物的相对含量；

(2)主成分分析：

①将步骤(1)获得的各个小分子代谢物的相对含量的数据进行标准化；

②用Markerlynx软件对步骤(2)中步骤①获得的标准化后的数据进行主成分分析，得到用于表达样本相似性和差异性的得分图和载荷图；在得分图中，样品点相互之间距离越近，说明样本的相似度越大，距离越远，说明样本差异越大，用来比较生产过程中各个阶段内细胞内小分子代谢物的相似和差异；在载荷图中，每个点表示各个小分子代谢物，距离中心点距离越远的小分子代谢物，其在维生素C发酵生产过程中的差异就越大，可作为重要的候选代谢物进行分析；

(3)过程分析

将步骤(2)得到的候选代谢物中对细胞生理状态具有重要意义物质的含量按照时间序列制成图表，观察并分析这些物质变化的规律，进而发现其在维生素二步发酵过程中的作用。