[发明专利]赖氨酸的顺式发酵制备

说明书

技术领域

本发明属于氨基酸发酵领域，具体而言，本发明涉及L-赖氨酸的发酵方法，其包括将编码吡啶核苷酸转氢酶变体的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌，从而使所获得的菌表达所述吡啶核苷酸转氢酶变体；和在发酵条件下培养获得的菌。另外，本发明还提供了所述发酵方法中所用的中间产物，和利用所述发酵方法进一步生产产品等。

背景技术

L-赖氨酸是重要的氨基酸原料，可以作为调味品、食品、饲料添加剂使用，也可以作为保健品、药品中的有效或辅料成分，广泛应用于食品业、饲料业、制药业及其他化学工业中。当前，L-赖氨酸的生产主要是通过微生物的发酵生产的，如可以利用棒状杆菌生产。

用于发酵生产的微生物可以是野生型微生物，但是更多的是通过诱变或基因工程获得的产量更高的营养缺陷型、耐药变异型和代谢变异型微生物。对于基因工程获得的性状改良的微生物来说，其中至关重要的就是性质优异的基因。

吡啶核苷酸转氢酶是L-赖氨酸代谢途径上重要的酶。尽管野生型吡啶核苷酸转氢酶的亚基已经被公开(可参见NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)蛋白和基因登录号NP416120.1和AAC74674.1；也可参见中国专利ZL94194707)，但是该酶变体的研究却没有报道。

本发明人经过长期艰苦研究，令人意外地发现了新的吡啶核苷酸转氢酶，其显著提高了相应酶的活性，在导入工程菌发酵的时候也获得了更高的赖氨酸产量。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供L-赖氨酸的发酵方法，其包括将编码吡啶核苷酸转氢酶变体的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌，从而使所获得的菌表达所述吡啶核苷酸转氢酶变体，其中所述吡啶核苷酸转氢酶变体相对于野生型吡啶核苷酸转氢酶的活性提高。另外，本发明还提供了所述发酵方法中所用的中间产物，和利用所述发酵方法进一步生产产品等

具体而言，在第一方面，本发明提供了L-赖氨酸的发酵方法，其包括：

(1)将编码吡啶核苷酸转氢酶变体的多核苷酸导入产L-赖氨酸的菌，从而使所获得的菌表达所述吡啶核苷酸转氢酶变体，其中所述吡啶核苷酸转氢酶变体相对于野生型吡啶核苷酸转氢酶的活性提高；和

(2)在发酵条件下培养步骤(1)获得的菌。

其中，野生型吡啶核苷酸转氢酶是本领域技术人员所知晓的，包括α亚基和β亚基，其中α亚基和β亚基的序列分别如NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)蛋白和基因登录号NP416120.1和AAC74674.1所示。酶活性的测定方法是现有已知的，如可以采用本发明具体实施方式中所述的方法来测定酶活性，这样就可以确认吡啶核苷酸转氢酶变体的活性是否有提高。

优选本发明第一方面的发酵方法中，所述多核苷酸依次编码吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体和吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体，即编码吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体的多核苷酸位于编码吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体的多核苷酸的上游。在本发明的具体实施方式中，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

其中，所述吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体在M102、L127或Q322的位置上被其他天然氨基酸替换，优选替换选自M102L、L127R和Q322K，最优选其氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。本领域技术人员可以根据吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体的氨基酸序列推导出其编码核苷酸序列，优选是密码子优化的核苷酸序列，如针对发酵所用的菌密码子使用情况优化的。在本发明的具体实施方式中，所述吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体由如SEQ ID No：3所示的多核苷酸编码。

另外，其中所述吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体在A398或D400的位置上被其他天然氨基酸替换，优选替换选自A398S和D400H，最优选其氨基酸序列如SEQ ID No：4所示。本领域技术人员可以根据吡啶核苷酸转氢酶α亚基变体的氨基酸序列推导出其编码核苷酸序列，优选是密码子优化的核苷酸序列，如针对发酵所用的菌密码子使用情况优化的。在本发明的具体实施方式中，所述吡啶核苷酸转氢酶β亚基变体由如SEQ ID No：5所示的多核苷酸编码。