[发明专利]肿瘤治疗型人肝素酶MAP疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，包括获得与人HLA-A2.1分子结合的肝素酶多抗原肽分子，以及编码这些多肽的DNA、RNA，由于这些多肽与人HLA-A2.1进行结合后可诱导特异性CTL反应，有效杀伤肝素酶阳性的肿瘤细胞，达到治疗中晚期肿瘤的目的。

背景技术

随着免疫学的发展我们认识到：CD8+T淋巴细胞识别靶抗原并非识别抗原的全长序列，而是识别抗原中一段8-11个氨基酸构成的多肽，这一段被CD8+T淋巴细胞识别的氨基酸序列称为CTL表位。

肝素酶是1999年由四个不同的实验室克隆成功的一种肿瘤转移相关基因。其表达产物内β-D-葡糖糖苷酶能特异性识别、切断硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)的硫酸肝素(HS)侧链。而HSPG是细胞外基质(ECM)和基底膜(BM)的主要成分，在组织构成、血管形成和细胞粘附等诸多方面发挥着极其重要的生理作用。高度水化的HS侧链极其带有的负电荷形成结构致密的选择性分子筛，是阻止肿瘤细胞侵袭扩散的首要屏障之一，而且伸展的HS侧链还储备着大量的生长因子、趋化因子和酶类等生物大分子物质。肝素酶促进肿瘤转移的主要机制在于：(1)通过降解HSPG途径破坏ECM、BM的完整性，使膜的屏障功能减退，利于肿瘤细胞的浸润及转移；(2)促进肿瘤血管生成。肝素酶可通过直接、间接两种方式发挥促血管生成作用。一方面肝素酶可直接作用于内皮细胞以出芽方式促进血管生成，另一方面，bFGF作为最强的血管生成诱导因子，平时以无活性形式与乙酰肝素结合贮存于ECM中，当HSPG被肝素酶裂解时，可将结合的有高度活性的HS-bFGF复合物从微环境中释放出来, 间接诱发血管生成反应。此外，另一种被固化在HSPG上的血管生成因子, 即血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，在肝素酶裂解HSPG的过程中也得到释放并被激活，与bFBF共同诱导肿瘤血管生成，在肿瘤的生长转移中，新生血管的生成为转移的肿瘤提供了非常便利的物质基础和通道。我们既往的研究表明，肝素酶mRNA的表达水平与胃癌的生长、浸润及转移密切相关。体外研究发现不同转移潜能的乳腺癌细胞株其肝素酶基因表达是不同的，低转移细胞株检测不到肝素酶mRNA的表达和蛋白活性，而高转移细胞株中肝素酶大量表达。将肝素酶全长cDNA转染至低转移潜能的小鼠淋巴细胞瘤和黑色素瘤细胞株后，肿瘤细胞的转移潜能明显增强，而肝素酶抑制剂PI88、硫酸昆布多糖或者反义分子则能明显降低肿瘤细胞的转移能力。

在此研究的基础上，我们将肝素酶全长基因序列构建到pDC-315腺病毒载体上，该病毒疫苗能在体外诱导肝素酶特异性的CTL反应，杀伤肝素酶阳性并且HLA-A匹配的胃癌细胞株。但是病毒疫苗具有其危险性，病毒的基因序列可能整合到正常细胞，而且这种整合无法控制，其安全性差，所以病毒疫苗目前极少应用于临床。而通过以上研究我们可以判定，在肝素酶全长序列中肯定存在CTL表位，并且这种表位被抗原递呈细胞(APC)递呈后能诱导特异性的抗肿瘤免疫效应。

德国学者预测并鉴定了三条肝素酶表位，能诱导CTL杀伤肝素酶阳性的乳腺癌细胞，并申请了专利。但是9肽疫苗具有其致命的弱点：分子量小、抗原性弱、在体内非常容易被降解因而半衰期太短无法诱导有效的CTL反应，达到诱导机体产生抗肿瘤免疫效应的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种肝素酶表位多抗原肽疫苗，通过改造该肝素酶CTL表位疫苗的结构，使其分子量增大、稳定性增强、在体内半衰期延长，以增强其抗原性，以达到在体内不易被降解，有充足的时间与抗原递呈细胞接触，被抗原递呈细胞递呈而达到诱导机体产生特异性的抗肿瘤免疫效应。

本发明的另一目的是提供所述肝素酶表位多抗原肽疫苗(MAP)在制备临床治疗和检测肿瘤相关疾病得药物或疫苗中的应用。

本发明根据Tam实验室提出的多抗原肽(multiple antigen peptides,MAP)的设计方案采用分子量小且免疫原性弱的赖氨酸为核心基质，将其与肝素酶CTL表位多肽耦联在一起，形成树枝样结构，这种设计模式在加强了抗原优势表位的肽链结构特异性的同时，还增大了抗原的分子质量，不仅很好的模拟了天然表位的空间构象，而且还不需要再耦联载体蛋白就能诱生较强的免疫反应，在疫苗的研发和肿瘤免疫治疗上具有重大的应用前景，这种MAP疫苗的设计原理不仅适用于T细胞表位，而且亦适用于B细胞表位。这样改造后肝素酶表位的抗原性、稳定性均得到大幅度的提高，而且在体外容易合成，方便临床应用。