[发明专利]甲型H1N1流感病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的PCR试剂盒，尤其涉及一种甲型H1N1流感病毒一步实时荧光定量RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction，反转录酶-聚合酶链锁反应)试剂盒。

背景技术

流感病毒属于正粘病毒科，分节段单股负链RNA病毒。根据其核蛋白和基质蛋白抗原性不同，流感病毒主要分为A、B和C型或者为甲、乙和丙三种类型。其中A型流感病毒可以感染人类、禽类和其他一些哺乳动物，如猪等。而B型和C型流感病毒目前的证据显示主要是感染人类。据流行病学资料显示，目前引起人群流行性感冒流感的主要是A型和B型流感病毒。2009年4月在墨西哥暴发并导致全球广泛传播和数百人死亡的流感病毒被命名为甲型H1N1流感病毒，该病毒属于A型流感病毒的H1N1亚型，它是猪流感病毒，人流感病毒和禽流感病毒通过基因片段重组后产生的一种新型混合型病毒株。针对流感病毒建立快速高效的实验室检测技术，对于疑似病人的及时诊断和治疗以及卫生检疫部门和国家疾控部门开展有效的传染病监控和流行病学调查研究等都具有非常重要的意义。

2009年4月份，一种新的流感病毒——甲型H1N1流感病毒的毒株被鉴定。虽然做好了充分的防御准备，但是病毒还是继续传播着。随后2009年7月份，世界卫生组织宣布全世界进入防御流感病毒的紧急状态，预示着一种新型的全球流行病的大爆发。对比于季节性的流感病毒株，甲型H1N1流感病毒的传染性更高。在大多数病例中，病情状况是温和、低死亡率；尽管如此，担心仍然存在。由于北半球冬季流感疫情将要爆发第二次冲击，甲型H1N1流感病毒可能会获得更高的毒性。目前在感染的早期及时采用抗病毒类药物治疗流感患者效果显著、治愈率高，因此为了早诊断早治疗针对疑似患者的流感病毒实验室快速筛查技术显得非常重要且意义重大。实时荧光定量RT-PCR技术是一项快速、准确和特异的流感病毒核酸检测技术。实时荧光定量RT-PCR技术被证明能够胜任临床流感病毒的诊断，这种技术能代替传统的病毒培养和抗原检测等方法。

发明内容

本发明的目的就在于提供一种甲型H1N1流感病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒。

本发明的目的是这样实现的：

1、甲型H1N1流感病毒一步实时荧光定量RT-PCR试剂盒(简称试剂盒)

本试剂盒是在对甲型H1N1流感病毒核酸序列分析的基础上，选取保守基因序列设计出一对特异性引物和一条特异性的荧光探针，利用实时荧光定量RT-PCR技术对甲型H1N1流感病毒进行检测。此技术不仅缩短了操作时间，减少了污染，也降低了样品诊断的成本，具有潜在的应用价值。

在按下述方法设计的引物和探针存在下，在荧光定量PCR仪中，对病毒核酸进行PCR扩增，来实现对流感病毒A型的检测。

本试剂盒包括甲型H1N1流感病毒的一对特异性引物(F和R)、一条特异性荧光探针(FP)、阳性对照、阴性对照、一步5×RT-PCR Buffer和Enzyme Mix；

①甲型H1N1流感病毒的一对特异性引物(F和R)

依据甲型H1N1流感病毒HA基因保守序列设计：

F：5’-ATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCC-3’24bp

R：5’-GATGCTGCCGTTACACCTTTGTC-3’ 23bp；

②甲型H1N1流感病毒的一条特异性荧光探针(FP)

依据甲型H1N1流感病毒HA基因保守序列设计：

FP：FAM-AACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGT-BBQ  29bp

荧光探针5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记荧光淬灭基团BBQ；

③阳性对照

甲型H1N1流感病毒标准品；

④阴性对照

RNase Free H₂O；

⑤一步5×RT-PCR Buffer配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存；

⑥Enzyme Mix配制：

配置混合后于冰箱-20℃保存。

2、本试剂盒的使用方法

①病毒核酸的提取：

A、首先在缓冲液1、2中加入无水乙醇，分别加入25ml和30ml无水乙醇；在漂洗液中加入30μg/ml carrier RNA；

B、取30μl蛋白酶放入1.5ml离心管中；