[发明专利]野葛葡糖基转移酶基因PlUGT4的克隆方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因的的克隆方法，特别涉及野葛葡糖基转移酶基因PlUGT4的克隆方法。

背景技术

野葛（Pueraria lobata (Willd.) Ohwi）是豆科植物葛属，其根作为中国传统中药已有相当长的历史。葛根味甘，性辛凉，归脾、胃经。具有升阳、活血、通络的作用，其有效药用成分是异黄酮类化合物葛根素、大豆甙、大豆甙元等。其中葛根素含量高、药性好，可显著改善冠心病患者心肌供血，治疗不稳定性心绞痛、室性期前收缩；降低血糖、血脂、抗氧化、增加血液流动性，降低肺动脉高压，治疗糖尿病性周围神经病变以及改善胰岛素抵抗等作用（Song et al.，1988；Xu et al.，2005；黄筑艳等，2007）。    对野葛生物合成葛根素的途径，尤其是调节酶的研究一直得到关注，已从野葛克隆了查尔酮合酶基因 (Nakajima et al., 1996；Yamaguchi et al., 1999)，克隆的查尔酮-异黄酮异构酶在大肠杆菌表达(Terai et al., 1996)，野葛查尔酮还原酶基因在烟草中表达（Joung et al.，2003）。上述野葛合成代谢相关基因的表达与葛根素生产间的相关性研究尚未有报道。目前认为，葛根素的生物合成是异甘草素在葡糖基转移酶作用下，C₈位通过C-C连接一个葡萄糖基形成C-葡糖基查尔酮中间体，接着自身脱水形成葛根素，其C-糖基化发生在查尔酮阶段。已知模式植物拟南芥、水稻中有催化几种连接键混合的葡糖基转移酶，但缺乏单独催化C-葡糖基转移酶的氨基酸序列，无法调出C-葡糖基转移酶的cDNA和氨基酸序列，因此，从野葛中克隆糖基转移酶并研究其功能，为认识调节植物体内葛根素生物合成途径和调控研究提供依据，为微生物工程大规模生产葛根素提供基础，在理论和应用方面具有重要意义。     已经报道指出，不同种属的生物、同一生物个体的不同组织、同一组织的不同发育阶段、甚至同一细胞株的不同时相，其糖基转移酶的表达也有差别(Bettina et al.，2005)，例如苜薯具有一系列糖基转移酶的基因序列以及这些糖基转移酶绝大部分参与了类黄酮代谢，科学家将参与次级代谢的糖基转移酶的保守序列称为PSPG框（Hughes and Hughes, 1994）。PSPG框由靠近蛋白C端大约40个氨基酸组成，保守性很强，达到60%-80%，在进化上也作为一个筛选糖基转移酶的基因的标志（Gachon et al.，2005）。现阶段，普遍利用同源基因克隆及RACE技术克隆糖基转移酶基因，但是如果引物设计不当，反应条件控制不好，根本无法克隆出完整的目的的。

野葛葡糖基转移酶基因PlUGT4是新发现的一种糖基转移酶基因，其Genebank登陆号为EU889122，全长1590bp，其序列如SEQ ID NO. 9所示，其蛋白序列如SEQ ID NO.10所示。该基因可广泛应用于野葛品质的改良，尤其是野葛作为药用植物的开发和利用等领域。但是目前缺乏有效的克隆方法。

发明内容

本发明的目的在于提供野葛葡糖基转移酶基因PlUGT4的克隆方法。

本发明所采取的技术方案是：

野葛葡糖基转移酶基因PlUGT4的克隆方法，包括以下步骤：

1)  提取野葛的总RNA，反转录得到cDNA；

2)  以cDNA为模板，以简并引物UGTD-F：5′ TTYGTNACNCAYTGYGGNTGGAA 3′（SEQ ID NO.1）和UGTD-R：5′ TCCATNAGNCTNCGNCANGCYTTYTCDAT 3′（SEQ ID NO.2）为引物，进行温度梯度PCR，得到cDNA，其反应条件为：94℃预变性5 min，94℃变性30s，54℃～63℃30s ，72℃延伸30s，20～40个循环，最后72℃延伸10min，得到中间序列；

3)  以步骤1）得到的总RNA为模板，3′ RACE T：5′ GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT 3′（SEQ ID NO.3）为引物反转录得到cDNA；

4)  以上一步骤得到的cDNA为模板，巢式PCR得到野葛葡糖基转移酶基因PlUGT4的3′ 末端序列；

5)  以步骤1）得到的总RNA为模板，采用TaKaRa公司5′-Full RACE Kit 获得野葛葡糖基转移酶基因PlUGT4的5′ 末端序列；