[发明专利]用于CHO细胞DNA残留检测的试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种定量检测CHO细胞DNA(即中国仓鼠卵巢细胞基因组DNA)残留的试剂盒及其使用。

背景技术

通过哺乳动物细胞培养表达制备治疗性重组蛋白质药物已经成为当今生物制药领域的主流技术，目前已经上市和正在进行临床试验的蛋白质药物中，70％来自于哺乳动物细胞，而这其中CHO细胞是最常用的细胞系。CHO细胞来源于中国仓鼠的卵巢细胞，目前，它是重组蛋白质生产的首选体系；因为与其他表达系统相比，它具有许多优点：1)具有准确的转录后修饰功能，表达的药物蛋白能通过CHO细胞进行糖基化修饰，其产物在分子结构、理化性质和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；2)表达产物分泌于培养液中，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的表达稳定；4)具有贴壁和悬浮生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，能在无血清培养基中高密度培养，且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。目前已有数十种CHO细胞表达和生产的产品投放市场，例如促红细胞生成素(EPO)、白细胞介素(IL)、凝血因子(VII，IX)、治疗性单克隆抗体(如：Avastin、Erbitux、Herceptin、Rituxan)等。

为了确保治疗性重组蛋白质药物的产品质量，欧美食品和药品管理局以及我国国家食品药品监督管理局都对药品中宿主细胞残留DNA量提出了明确的要求。分子杂交分析以及immunoassay分析具有灵敏度低、耗费时间长、不易定量检测等缺陷。

定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光染料，利用荧光信好积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术具有灵敏度高、特异性强、结果准确、自动化程度高和实时性等特点。SYBR Green是一种最为常用的燃料，但因其与DNA亲和力强，故通常对PCR反应有抑制作用；Taqman探针灵敏度较高，特异性强，但其价格昂贵，国外相关试剂盒每个96孔板的检测价格大于3000美元，极大地限制了其使用。

本发明的荧光PCR方法克服上述已有定量PCR检测方法灵敏度低、实施费用高等缺点，提供一种简单、廉价、准确率高的定量荧光PCR检测方法以及用于该方法的试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种使用实时荧光PCR技术来定性与定量检测CHO细胞DNA的试剂盒，特别是本试剂盒可用于检测治疗蛋白质药物、重组疫苗及单克隆抗体等产品CHO细胞残留DNA，从而对重组蛋白质药物生产过程进行质量监测。

本发明的试剂盒以EvaGreen为荧光染料，基于实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术快速、准确、定量检测重组的治疗蛋白质药物、重组疫苗及单克隆抗体中CHO细胞残留DNA含量的试剂盒。

本发明试剂盒的基本原理是利用一对靶多核苷酸的特异性引物，在本试剂盒PCR扩增反应液中，通过荧光定量PCR扩增仪实现靶核苷酸的循环扩增，从而达到快速、定量检测多核苷酸的目的。

本发明所提供的检测重组蛋白样品中CHO细胞残留DNA的试剂盒包括：分别装有PCR扩增反应液、CHO细胞基因组DNA定量参考品、阴性质控品、阳性质控品以及DNA稀释液的多个试剂瓶或管，所述试剂瓶或管加盖密封。

所述PCR扩增反应液含有Taq酶、EvaGreen荧光染料、dNTPs、Rox染料、Mg²⁺、PCR缓冲液、正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物为Genebank登录号为EF540878.1序列的特异性引物。所述正向引物与反向引物之间相距30-250个碱基。所述PCR扩增反应液能和该对引物的靶序列结合，产生高度灵敏、特异性高的检测信号。

所述DNA稀释液可为常规。优选由EDTA、NaOH和Tris-HCl溶液配制而成，其中Tris-HCl浓度为5.0-10.0mM/L，EDTA的浓度为0.5-1.0mM/L，用NaOH溶液调节pH为6.0-8.5。该DNA稀释液能高效稀释低浓度的DNA样品，而且适合于PCR扩增。

进一步的，所述特异性引物是根据Genebank登录序列(登录号：EF540878.1)，通过引物设计软件设计的，特异性引物包括正向引物CHO-F和反向引物CHO-R：

CHO-F：5’-CTGGCAGACATCTAAATATC-3’(SEQ ID NO：1)，

CHO-R：5’-TAGCAGACACTGTTGTAGAG-3’(SEQ ID NO：2)。