[发明专利]一步法复合检测烟草普通花叶病毒与马铃薯Y病毒的方法及其引物

权利要求书

1.一步法复合检测烟草普通花叶病毒与马铃薯Y病毒的方法，其特征在于：该方法包括甄别比对病毒基因组中保守区域，人工筛选合成适用于两种病毒病复合RT-PCR特异性引物；分析获得TMV、PVY复合侵染烟叶样本，整合反转录和PCR反应所需酶和缓冲液，通过反应条件优化，建立基于一步法RT-PCR复合检测烟叶感染TMV、PVY的方法。

2.根据权利要求1所述的一步法复合检测烟草普通花叶病毒与马铃薯Y病毒的方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）使用DNAMAN6.0对GenBank中收录的TMV和PVY病毒各株系、各区域分离物全基因组序列做比对，确定病毒序列中的相对保守区域，在选定的保守区域内使用Primer Premier软件设计引物，选定两对引物：

PVY：上游引物(PF) 5’-GGATCAATGCATCCTGTCATAC-3’ ；

下游引物(PR) 5’-GCYTTGTCAGACCAATCTTTCC-3’ ；

TMV：上游引物(TF) 5’-CGGAGATCTCGACAGTCATGTG-3’ ； 

下游引物(TR) 5’-TACAGGCGTAAACATCGACGG-3’ ；

引物由上海生工生物工程有限公司合成，按照合成说明书用去RNase水溶解至工作浓度20Μm；

（2）检测分析大田烟区采集的病毒烟叶样品，找到TMV、PVY侵染的烟叶样品；

（3）烟叶总RNA的提取；

（4）一步法复合RT-PCR反应条件的建立

本实验RT-PCR使用TaKaRa公司的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2，经过优化的反应体系：Enzyme Mix 1.5μl；1 Step Buffer 12.5μl；PVY上、下游引物各0.4μl，TMV上、下游引物各0.25μl，；RNA 2μl；去RNase水7.7μl，反应条件：50℃反转录30min，94℃热失活2min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1.5min，30个循环；72℃补充延伸10min，扩增产物取5~10μl在1%琼脂糖凝胶中电泳检测。

3.根据权利要求2所述的一步法复合检测烟草普通花叶病毒与马铃薯Y病毒的方法，其特征在于：步骤（2）中使用Agdia公司TMV、PVY诊断试剂盒PathoScreen                                               TMV、 PathoScreenPVY检测分析大田烟区采集的病毒烟叶样品，通过血清学方法找到TMV、PVY侵染的烟叶样品。

4.根据权利要求2所述的一步法复合检测烟草普通花叶病毒与马铃薯Y病毒的方法，其特征在于：步骤（3）中，采用异硫氰酸胍方法提取RNA，使用Bio Basic公司的Ez Spin Column Plant Isolation Kit提取总RNA。

5.一种如权利要求1所述一步法复合检测烟草普通花叶病毒与马铃薯Y病毒方法所用引物，其特征在于：所述特异性引物为：

PVY：上游引物(PF) 5’-GGATCAATGCATCCTGTCATAC-3’ ；

下游引物(PR) 5’-GCYTTGTCAGACCAATCTTTCC-3’ ；

TMV：上游引物(TF) 5’-CGGAGATCTCGACAGTCATGTG-3’ ；

下游引物(TR) 5’-TACAGGCGTAAACATCGACGG-3’。