[发明专利]枯草芽孢杆菌表面展示人血清白蛋白重组芽孢及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及表面展示外源蛋白的重组芽孢的制备方法及产品，具体指的是在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示人血清白蛋白HSA的重组芽孢，属于重组融合蛋白药物技术领域。

背景技术

人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)是由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子质量约为66.5 kD (Mingetti, et al. 1986. J.Biol.Chem. 261,6757)，等电点在4.7～4.9之间。HSA是人血浆中最丰富的蛋白质，占血浆总蛋白的60%左右。在体液中人血清白蛋白可以运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离子和许多治疗分子等，同时能够维持血液的渗透压保持在一个适当的水平。由于HSA作为血液最重要的运载工具和血浆蛋白成份，在机体内发挥着重要的生理功能，因而在临床医学实践中具有十分广泛的用途，被大量用来治疗各种休克、烧伤、战伤、外科手术和工伤事故等各种病因引起的血容量减少病人，以及慢性肾炎、肝炎、肝硬化和晚期恶性肿瘤病人，营养不良水肿症、低白蛋白血症和无白蛋白血症病人等。HSA对细胞具有较高的营养价值。HSA由较多的必需氨基酸组成，是均衡、齐全的氨基酸来源。滋养细胞的蛋白质约1/3来自肝脏合成的HSA。肝脏每日合成的HSA几乎全部被各种组织细胞消耗，HSA离开血液系统，抵达细胞膜，进入细胞内，水解后再合成各种蛋白质。由于HSA适应症多、用量大（每个病人每天用HSA的量将近10g），因此HSA拥有巨大的市场需求量。目前HSA的全球市场年需求量约600t，其中中国对HSA的年需求量约为70t。临床上HSA主要是靠收集人的血液通过分级过滤获得，但是人血浆来源有限，价格昂贵，并且来源复杂，容易导致血源性污染，如肝炎病毒，艾滋病毒等。目前已有通过基因工程的方法用酵母发酵生产重组人血清白蛋白上市，但要实现药物级重组人血清白蛋白的大规模生产，发酵法仍然有许多的缺点和不足，因为重组人血清白蛋白产品对纯度要求极高，纯度要求达到99.999999%以上，任何微量的杂蛋白都可能造成严重的免疫反应。这使得发酵法生产重组人血清白蛋白的分离纯化方法和步骤复杂，生产成本较高。

枯草芽孢杆菌为环境友好型细菌，在营养缺乏时，能形成处于代谢休眠状态的芽孢，在适宜条件下芽孢又能萌发成具有繁殖能力的营养细胞。芽孢容易培养，比重大易分离、不需要复杂的分离纯化操作。芽孢是生命世界中抗逆性最强的一种结构，其稳定性好，能耐氧化，耐高温，能长期耐60℃高温，在120℃的温度下能存活20分钟，并且在抗化学药物和抗辐射等方面也十分突出，可在恶劣环境中存活几年至几十年。芽孢在酸性胃环境中能保持活性，可以耐唾液和胆汁的攻击，可以顺利通过动物消化道，可作为极端环境（如胃肠道）下异源蛋白或生物活性分子的载体(Oggioni MR, et al. 2003. Vaccine. 21: 96-101)。枯草芽孢杆菌以孢子状态进入消化道后，迅速由休眠状态复活，在短期内繁殖成高含菌量的优势种群，消耗掉肠道内大量氧气，并能产生过氧化氢、细菌素，建立微生态平衡，促进有益厌氧微生物的繁殖，抑制有害细菌（大肠杆菌、沙门氏杆菌）的生长，因而能预防腹泻、下痢等肠胃道疾病。目前市场上已经有口服枯草芽孢杆菌活菌胶囊产品，如北京紫竹药业有限公司，国药准字S20030018，表明枯草芽孢杆菌芽孢可以通过人口服使用而产生药效性。

本发明的目的在于利用芽孢独特的抗逆性，以益生菌枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白为载体，通过芽孢表面展示技术将人血清白蛋白展示在芽孢表面，使人血清白蛋白获得快速大量表达的同时具有良好的抗逆性，适用于快速大量制备具有药效性的重组人血清白蛋白的口服营养品。该产品在保持了枯草芽孢杆菌芽孢生理特性的基础上同时具有人血清白蛋白的药效性和营养功能，迄今尚未见类似的报道和发明专利。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种表面展示人血清白蛋白HSA的重组芽孢的制备方法和产品。本发明以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC为载体，通过芽孢表面展示技术将人血清白蛋白展示在枯草芽孢杆菌的芽孢表面，可用于动物直接口服，成为一种新型的人血清白蛋白药物营养品或者动物营养品，其在安全性、耐受性、药效学以及药代动力学等方面与人源HSA具有类似的功效。相对于其它注射型人血清白蛋白产品，本发明表面展示人血清白蛋白的制备方法和分离过程简单快速，具有更广泛的应用价值。这种产品的发明克服了当前人血清白蛋白来源于血液制品的限制，同时也克服了重组酵母发酵生产的人血清白蛋白分离纯化过程复杂的缺点，在药学领域具有良好的应用前景。