[发明专利]一种无标签结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE和其制备方法，以及其在制备结核亚单位疫苗中的应用。

背景技术

结核病是长期危害人类健康的严重疾病之一。全世界仍有近1/3的人感染过结核分枝杆菌。大约有5％的结核感染者在2-5年内会发展为肺结核病人；其余的有可能会形成结核病的潜伏感染者。我国是结核病高负担的国家之一，每年约有13万人因结核病而死亡。目前，卡介苗BCG的接种是有效预防结核病的重要措施。然而，不同研究显示，BCG在不同人群中的保护性不稳定，尤其是对成人肺结核的保护效率介于0-80％不等。因此，研制和开发全面高效的抗结核疫苗是控制结核病的重要途径。可供研究的抗结核疫苗有：亚单位疫苗，重组BCG，减毒的MTB活疫苗。而亚单位疫苗又包括蛋白疫苗，DNA疫苗和以病毒为载体的疫苗；其中的蛋白疫苗具有成分明确，使用安全等优点，相对易于被人们接受。

利用基因工程技术将具有优势的不同的单个结核保护性抗原进行重组，从而构建成融合蛋白。大量研究表明，与单个抗原相比，融合抗原的免疫原性会增强，显示出更好的保护效果；因此受到国内外研究的重视。

然而在以往的研究中，为了后期简便的纯化方法，往往构建成带有各种标签(如His·Tag，GST·Tag，S·Tag等)形式的融合蛋白，却未考虑这种融合蛋白所带有的标签是否会影响到动物实验以及更进一步的临床学试验的认可。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种无标签结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE，是序列表中序列2的蛋白质。

本发明的另一个目的是提供一种上述无标签结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE的编码基因。

所述融合蛋白ESAT6-RpfE的编码基因，是如下1)或2)的基因：

a)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

b)在严格条件下与a)限定的DNA序列杂交且编码所述融合蛋白ESAT6-RpfE的DNA分子。

含有上述融合蛋白ESAT6-RpfE的编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体为PET30a质粒。

含有上述重组表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。

本发明的第三个目的是提供一种上述无标签结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE的制备方法，包括有以下步骤：

1)获得上述结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE的编码基因；

2)将步骤1)得到的结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE的编码基因导入重组表达载体；

3)将步骤2)载体导入宿主细胞；

4)培养步骤3)得到的宿主细胞；

5)将步骤4)得到的宿主细胞进行处理得到上述结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE并纯化和表达。

所述编码基因为序列1所示的核苷酸序列；所述重组表达载体为PET30a质粒；所述宿主细胞为大肠杆菌BL21。

本发明的第四个目的是提供一种上述无标签结核杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE在制备抗结核的候选疫苗中的应用。

本发明选用的结核分枝杆菌早期分泌蛋白ESAT6，其具有多个T细胞、B细胞表位，是抗结核免疫反应的主要配体，有较强的免疫原性和免疫反应性。ESAT6能成为检测MTB抗体的特异性抗原，其优势是能区分MTB自然感染和BCG接种以及非致病性分枝杆菌感染后产生的抗体。另外RPF(Resuscitation Promoting Factor)是一种细菌复活生长因子，以自分泌或旁分泌的形式促进休眠菌的复苏和生长，也是细菌生长真正必需的分泌蛋白之一.结核分枝杆菌H37 Rv株的基因Rv0867c(RpfA)、Rv1009(RpfB)、Rv1884c(RpfC)Rv2389c(RpfD)、Rv2450c(Rpf E)均编码具有同源性的RPF样蛋白，RPF蛋白是迄今为止发现的第1个能使休眠的细菌恢复生长繁殖能力的分泌型蛋白，是宿主免疫系统识别的靶抗原，能引起较强的免疫应答，刺激宿主机体产生的特异性抗体，能阻断RPF蛋白对MTB的作用，阻止MTB在体内的复苏和复发，因此RPF蛋白可能是预防和控制MTB感染的一种新型途径。

基于以上的研究背景情况，本发明利用基因工程技术，克隆构建了无任何标签的结核分枝杆菌融合蛋白ESAT6-RpfE，并且进行了表达和纯化，以期望成为抗结核的候选疫苗。

附图说明

图1为结核分枝杆菌基因RpfE体外扩增。

图2为重组质粒pET30a-ESAT6的PCR鉴定。

图3为重组质粒pET30a-ESAT6与基因RpfE的连接。