[发明专利]一种负载rhBMP-2壳聚糖微球及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白类生物活性因子载体及其制备方法，更具体地涉及一种负载重组人骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)壳聚糖微球及其制备方法。

背景技术

随着基因工程和生物技术的发展，越来越多的生物活性因子用于治疗和预防疾病。骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是转化生长因子β超家族成员之一，具有诱导未分化的间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞定向分化与增殖的能力，在修复骨缺损和促进骨愈合方面起重要作用(Reddi，A.H.，Bone morphogenetic proteins：from basic science to clinical applications.J Bone Joint Surg Am，2001，83-A Suppl 1(Pt 1)：S1-6)。但纯的重组人骨形态发生蛋白-2和其它细胞生长因子一样，容易被酶降解、体内半衰期短，在局部和全身应用很快被稀释代谢，生物利用度很低，所以重组人骨形态发生蛋白-2的有效发挥需要合适的载体。

壳聚糖(chitosan)是甲壳素的脱乙酰化产物，由2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖苷经糖苷键连接而成，是自然界中唯一的天然碱性多糖，也是少数具有正电荷的天然产物之一。许多实验表明壳聚糖具有良好的生物相容性和生物降解性，而且降解后的产物在体内安全、无毒副作用。目前，利用壳聚糖制备化疗药物、蛋白和基因等药物的缓释、控释微球已取得较好的效果。为达到药物的持续释放，通常采用交联剂对壳聚糖微球进行交联。冯庆玲等(Niu，X.，et al.，Preparation and characterization of chitosan microspheres for controlled release of synthetic oligopeptide derived from BMP-2.J.Microencapsulation，2009.26(4)：297-305)采用乳化—离子交联法制备载重组骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球，将蛋白与壳聚糖的混合溶液滴入含表面活性剂的液体石蜡中，乳化后滴入三聚磷酸钠溶液进行反应形成微球，产物采用大量石油醚、异丙醇清洗后冷冻干燥，体外累积释放7天达62.3％。黄鑫等将rhBMP与壳聚糖的混合溶液加入含表面活性剂的辛醇溶液中，乳化后采用生物交联剂京尼平进行交联，产物微球采用异丙醇、石油醚、水反复漂洗，制得的重组人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球体外释放可达30天。专利CN101637454采用静电液滴—离子交联法制备了人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球。在静电场下，将蛋白和壳聚糖的混合溶液滴入含三聚磷酸钠的凝胶浴中，形成人骨形态发生蛋白-2壳聚糖微球，体外缓释周期达4周以上。但是采用戊二醛、京尼平和三聚磷酸钠等交联剂制备的交联壳聚糖微球在体内的炎症反应程度较纯壳聚糖明显增加，并且交联降低了微球在体内降解速率(Mi，F.-L.，et al.，In vivo biocompatibility and degradability of a novel injectable-chitosan-based implant.Biomaterials，2002，23(1)：181-191)。同时制备过程中的界面效应、电压、超声搅拌等因素也易使蛋白失去活性，而且壳聚糖微球整个制备过程都要保持无菌操作，工艺相对繁琐。

发明内容

由于壳聚糖对蛋白有良好的亲和能力，壳聚糖微球可通过疏水作用、静电作用和氢键相互作用吸附蛋白，条件温和，操作简单，因此本发明的目的在于提供一种负载rhBMP-2壳聚糖微球，rhBMP-2吸附在所述壳聚糖微球上，不仅吸附容量高，且rhBMP-2不易失活。

本发明的另一目的在于提供上述微球的制备方法。

本发明的再一目的在于提供上述微球的应用。

本发明的负载rhBMP-2壳聚糖微球，基质为壳聚糖微球，负载的药物为rhBMP-2，所述rhBMP-2吸附在所述壳聚糖微球上，且rhBMP-2与壳聚糖的重量比为1～30∶100。

根据本发明，所述壳聚糖微球的平均粒径为1～300μm。

根据本发明，所述壳聚糖微球由壳聚糖与离子交联剂发生反应再采用氢氧化钠溶液处理制得。

本发明的负载rhBMP-2壳聚糖微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)、将壳聚糖溶液分散到含有表面活性剂的油相形成W/O型乳状体系；

(b)、将离子交联剂溶液加入到所述W/O型乳状体系反应1～12小时，加入丙酮，收集壳聚糖微球；