[发明专利]一种纤维素酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种纤维素酶的制备方法。

背景技术

农作物秸秆是自然界中最为丰富的可再生资源之一，在我国目前大部分未被充分利用，而是被烧掉，每年由于秸秆焚烧不仅造成环境污染，还造成大量的资源浪费。农作物秸秆的主要成份是纤维素、半纤维素和木质素，另外还有一些蜡质物质。因此，要有效的利用秸秆首先要解决纤维素的降解问题，如果能够将纤维素降解为可利用的糖类物质，不仅可用作养殖饲料，提高农民收入；对解决我国所面临的环境污染、粮食短缺等问题也有重大现实意义。目前纤维素被彻底分解而又无污染的一条有效途径是利用纤维素酶的水解作用。纤维素酶(Cellulase)是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，可将纤维素水解成葡萄糖。纤维素酶来源非常广泛，如昆虫、软体动物、原生动物、细菌、放线菌、真菌等都能产生纤维素酶。不同来源的纤维素酶其结构和功能相差很大，来源于真菌的纤维素酶酶系较全，活性强。目前用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌，研究较多的有木霉属、曲霉属、根霉属和漆斑霉属。特别是绿色木霉(Trichoderma viride)及其近缘菌株最佳，国内外普遍认为绿色木霉的纤维素酶产率最高，酶系最全。我国对纤维素酶的研究有几十年的历史，采用微生物发酵法生产纤维素酶的报道和专利有很多，但是普遍存在酶系不全，和酶活力不高的问题。目前主要的发酵方法有固态发酵和液态发酵。液态发酵生产稳定，占地面积小，方法容易掌握近年来越来越被重视；但纤维素酶为诱导酶，需要天然的纤维素类物质如稻草等为诱导物，所以液态发酵酶往往存在酶系不全的缺点，且培养要求条件高，应用成本高。固态发酵虽然利用天然秸秆资源，成本低，酶系齐全，设备简单，容易推广，但是占地面积大，发酵条件难控制。

发明内容

本发明提供了一种纤维素酶的制备方法，它不但可以提高酶的存活率，完善酶系，而且大大降低了成本。

本发明采用了以下技术方案：一种纤维素酶的制备方法，它包括以下步骤：步骤一，斜面孢子制备：选择绿色木霉作为发酵菌种，将保存的绿色木霉接种于斜面培养基中，静置培养，每日观察，一段时间后，在绿色木霉培养后的菌丝表面形成一层灰绿色孢子，灰绿色孢子既可用为斜面孢子；步骤二，液体种子制备：将斜面孢子接种于种子培养基中，达到108个孢子/ml然后进一步培养使孢子萌发，孢子萌发后即可作为种子；步骤三，将种子与发酵料质量比1∶10的比例，均匀的倒在发酵培养基上进行固态浅盘培养，拌匀、摊平，放入发酵培养室进行培养，从进入培养室开始，每隔一段时间需要向浅盘内进行浇水，根据浅盘中物料湿度大小可以减少或增加浇水量；步骤四，当培养到第七天、第八天和第九天时，分别这三天的浅盘内的物料进行采样，测定这三天中浅盘中物料的水分和酶活性，当纤维素酶活性大于110U/g干曲时即可结束发酵，发酵结束湿曲，无异味，蛋白含量高，可直接用于牛羊饲喂，酶活力高，牛羊消化率高，效果好。

本发明的步骤一中所述的斜面培养基容量为1L的制备方法：称取去皮新鲜土豆200克，切成小块，加水至1L，煮沸30分钟，用纱布过滤后加20克葡萄糖、15克琼脂粉，在电炉上加热至琼脂溶化，加水补足1L，分装至已空消过的试管中，置灭菌锅中121℃灭菌20分钟，倾斜静置，待凝固后备用。本发明的步骤一中所述的绿色木霉接种于斜面培养基中在35℃的条件下静置培养5天，每日观察，在5天后，在绿色木霉培养后的菌丝表面形成一层灰绿色孢子。

本发明的步骤二中的所述的种子培养基容量为1L的制备方法：葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏10g，硫酸铵5.0g，磷酸二氢钾6g氯化钙1g，七水硫酸镁1g，碳酸钙0.5g，PH值为5.6，分装，置灭菌锅中121℃灭菌20分钟。本发明的步骤二中斜面孢子接种于种子培养基中时在温度为30℃，转速为50r/min萌发培养6h，萌发后的孢子数含量为108个/ml。