[发明专利]一种提高动物繁殖力的干扰载体

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型载体的构建。具体而言，本发明针对绵羊干扰素INHA基因的核苷酸序列设计合成miRNA单链寡核苷酸，构建了miRNA慢病毒干扰载体，得到了具有良好应用前景的新型载体。

背景技术

人类首次从牛的睾丸组织中分离、纯化到了一种糖蛋白激素[McCullagh DR.DUAL ENDOCRINE ACTIVITY OF THE TESTES.Science，1932，76(1957)：19-20.]，根据其具有特异性地抑制垂体细胞分泌及合成促卵泡素(Follicle-Stimulating Hormone，FSH)的生物学活性而将它命名为抑制素(Inhibin，INH)，以后逐渐发现它在多个组织器官中广泛分布。抑制素分子由一个α亚基与一个β亚基通过二硫键连接而成。生物体中只有当α亚基与β亚基处于结合状态时，抑制素表现出生物活性。在生理状况下抑制素能选择性地抑制垂体合成和分泌促卵泡素，从而影响卵巢上卵泡的发育和成熟，是调节家畜繁殖力的重要生殖激素之一。

研究表明抑制素α亚基与动物繁殖性能之间存在密切的关系。采用PCR-SSCP技术检测抑制素α(inhibinα，INHA)基因5′调控区和外显子1在高繁殖力绵羊品种(小尾寒羊)以及低繁殖力绵羊品种(中国美利奴绵羊、考力代绵羊和南非肉用美利奴绵羊)中的单核苷酸多态性[周文然，储明星，孙少华，方丽，叶素成.小尾寒羊高繁殖力候选基因INHA的研究.农业生物技术学报，2007，15(1)：32-36.]，结果发现小尾寒羊、中国美利奴绵羊和考力代绵羊在INHA基因5′调控区发生了1处碱基突变(316C→T)，南非肉用美利奴绵羊没有发生这种突变；小尾寒羊和考力代绵羊在INHA基因外显子1中发生了1处碱基突变(877T→C)，中国美利奴绵羊和南非肉用美利奴绵羊没有发生这种突变；初步表明INHA基因可能是影响小尾寒羊高繁殖力的一个主效基因或是与之存在紧密遗传连锁的一个分子标记。对高繁殖力绵羊品种与低繁殖力绵羊品种之间抑制素α亚基基因多态性的研究发现，高繁殖力绵羊品种与低繁殖力绵羊品种之间基因型分布差异都极显著(P＜0.01)。田秀娥等[田秀娥，孙红霞，王永军.3个绵羊群体INHA基因的遗传多态性及对产羔数的影响.西北农林科技大学学报(自然科学版)，2010，38(1)：23-29.]用PCR-SSCP方法检测和分析3个绵羊品种(滩羊、蒙古羊和小尾寒羊)INHA基因的多态性，研究不同基因型对产羔数的影响，发现滩羊、蒙古羊和小尾寒羊P1(5′调控区282核苷酸处发生的1处A→G突变)位点C、D基因频率分别为0.840和0.160，0.852和0.148及0.162和0.838，均处于中度多态；P2位点E、F基因频率分别为0.784和0.216，0.787和0.213及1.000和0.000，滩羊和蒙古羊在该位点均处于中度多态；引物P3扩增片段中，滩羊和蒙古羊表现为A、B和C三种单倍体基因型，而小尾寒羊仅表现出A和B2种基因型。鉴于INHA对绵羊繁殖力的影响，Li Han等[Li Han，D.G. Mao，D.K.Zhang，A.X.Liang，M.Fang，Muhammad Moaeen-ud-Din，L.G.Yang.Development and evaluation of a novel DNA vaccine expressing inhibinα(1-32)fragment for improving the fertility in rats and sheep.Animal Reproduction Science，2007，109(2008)：251-265.]将抑制素α亚基(1-32)片段插入到HBsAg-S的羧基端，构建出一种抑制素DNA疫苗。用这种疫苗免疫40只绵羊，结果发现经过绵羊的实验组绵羊的双胎率(39.2％)显著高于对照组绵羊的双胎率(10％)(P＜0.05)。结果表明用针对抑制素构建的DNA疫苗进行免疫可诱导产生更多的卵泡，从而增加产仔数。此外许多研究也表明通过抑制素主动免疫，使动物产生抑制素抗体，解除内源性抑制素对垂体FSH合成和释放的抑制作用可以提高动物的繁殖力[Li C，Zhu YL，Xue JH，Zhang SL，Ma Z，Shi ZD.Immunization against inhibin enhances both embryo quantity and quality in Holstein heifers after superovulation and insemination with sex-sorted semen.Theriogenology，2009，71(6)：1011-7.Eamens AL，Waterhouse PM.Vectors and Methods for Hairpin RNA and Artificial microRNA-Mediated Gene Silencing in Plants.Methods Mol Biol，2011，701：179-97.]。