[发明专利]长叶红砂耐盐特有基因序列Rt-st14173在植物抗盐基因工程中的应用

说明书

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体地说，涉及一种特有盐生植物长叶红砂的耐盐性状基因。本发明选用内蒙古东阿拉善-西鄂尔多斯地区特有耐盐植物长叶红砂为试材，运用Illumina/Solexa转录组深度测序获得长叶红砂耐盐基因，对候选长叶红砂耐盐基因进行生物信息学分析，了解基因的功能及其履行的生物学功能。

背景技术

长叶红砂(Reaumuria trigyna Maxim.)，又名黄花红砂、黄花琵琶柴，隶属于柽柳科(Tamaricaceae)琵琶柴属(Reaumuria Linn.)，为古地中海残遗珍稀植物，是亚洲中部地区东阿拉善-西鄂尔多斯特有种，为该地区重要牧草之一，其生存环境极端恶劣，为典型的高原干旱半干旱季风气候区，该地区终年干旱、低温、高盐，年均降水量140.9～302.2mm，年均温度6.0～9.2℃，土壤含盐量可达0.4％。长叶红砂是典型的泌盐盐生植物，叶表面和幼茎表面分布着大量的8细胞盐腺，这一结构可有效的将植物体内过量的盐分排出体外，研究表明该植物可在500mM NaCl胁迫下正长生长。随着人类活动范围的不断扩大如基础设施建设用地、过度放牧等对生长在该地区的植物提出了巨大的生存挑战。现在该物种已被列为内蒙古自治区珍稀濒危植物。对长叶红砂研究的意义不仅仅在于对濒危物种的保护上，更重要的是对于这一生存在极端环境下的植物的基因水平上的开发和利用。目前对长叶红砂的研究主要集中在形态学、耐盐生理机理、激素及水分调节及生物多样性上，而关于该物种盐诱导及特有耐盐基因的克隆及利用方面仍均无报道。

诞生于20世纪70年代的Sanger法是最早广泛应用的DNA测序技术，也是完成人类基因组计划的基础。但随着科学技术的不断发展，2005年以来，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的新一代测序技术相继诞生。新一代测序技术又称作深度测序技术，主要特点是测序通量高、测序时间和成本显著下降。把这种高通量测序技术应用到由mRNA逆转录生成的cDNA上，从而获得来自不同基因的mRNA片段在特定样本中的含量，这就是mRNA测序或mRNA-seq。同样原理，各种类型的转录本都可以用深度测序技术进行高通量定量检测，统称作RNA-seq或RNA测序。

目前，在已经推出的几种新一代测序平台中，Illumina/Solexa测序平台上的RNA-seq应用最广。该技术已被应用到科学研究的各个领域，如2009年发表在Science上的有关家蚕驯化相关基因的研究中得到354个驯化候选基因，其中包括产丝重要相关基因Sgf-1；水稻研究领中发现在家养水稻及野生型水稻间有517个基因存在SNPs，目前452个源于野生稻的基因已被转入栽培稻中进行表达，其中24个基因在苗期表现出明显的表型差异，16个基因已经申请专利并被受理；此外，还运用该技术从基因组水平对青藏高原上藏人对高海拔的适应性给出了遗传学的解析，结果发现，西藏自治区2个村庄的50个藏民的外显子组，与40个北京汉人基因组数据进行比对，鉴定出一些高原适应候选相关基因。这些基因上发生的优异变异可被认为是西藏地区人类生存和繁衍后代的长期选择的重要结果。

据文献报道，关于RNA-seq技术的缺点尚未出现，但就该技术存在的难点和所面对的挑战进行了相关的描述。其中很重要的一点是高通量测序技术数据处理中的生物信息学挑战，也就是在测序所得数据做后续处理中怎样克服系统误差及解决偏好性的问题。以差异表达基因为基础的分析中，由于基因表达水平都是通过读段(reads)计数来估计的，表达水平较高或转录本较长的基因拥有更多的读段，更容易被多数统计方法识别为差异表达基因。这种偏好可能对后续分析带来影响。针对这种偏好性，Young等人发展了一种方法，较好的避开了这种偏好性。另外，在植物耐盐基因克隆及利用方明，目前大多集中在模式植物拟南芥、盐芥或水稻，小麦等作物上。对野生天然强抗耐盐植物的研究还比较少见，尤其是结合高通量测序技术系统性发据和筛选通过环境长期筛选出的盐胁迫相关基因。本发明获得的耐盐性状基因正是利用新一代测序技术对内蒙古特有耐盐植物长叶红砂转录组进行深度测序所得。

发明内容

本发明的目的是利用二代测序技术illumina/solexa系统，对内蒙古东阿拉善-鄂尔多斯特有盐生植物长叶红砂(室内培养幼苗)转录组进行De novo深度测序。对测序结果进行生物信息学分析后，得到该物种转录组中全部与非生物胁迫相关的基因序列(全长或部分)。最终筛选出NaCl处理前后在转录组水平表达量变化最明显的耐盐相关基因序列。