[发明专利]人RACK1与MKK7相互作用表位的确定及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质的功能表位的合理确定及应用。基于生物大分子间相互识别的空间结构信息，借助计算机辅助分析技术，合理预测生物大分子间相互识别的功能表位；通过生物学实验对预测的功能表位进行验证；进一步将该表位应用于抑制肿瘤生长。

背景技术

JNK是MAPK家族的重要成员。应激、生长因子、炎症刺激等多种胞外刺激因子可激活以JNK为中心的JNK信号转导通路。JNK通路的活化遵循经典的MAPK蛋白序列磷酸化模式。其上游激酶是MKK7。MKK7通过双磷酸化JNK的Thr183、Tyr185位点使JNK获得蛋白激酶活性。JNK活化以后，可以调控多种底物的功能活性，这些底物既包括bcl-2家族成员等胞浆蛋白，又包括c-jun、c-myc等核内转录因子。此外，JNK还通过磷酸化非依赖的方式调节p53等蛋白的稳定性。通过以上这些机制，JNK参与了多种生命活动的调节，例如细胞增殖、细胞凋亡、细胞分化、炎症因子的产生、迁移等。而JNK活性的紊乱又促进了多种疾病的发生和发展。MKK7-JNK途径在多种生理病理条件下发挥重要调控作用，研究这条通路的调节机制具有重要意义，可能为相关疾病的干预提供新靶点、新策略。

RACK1(激活的蛋白激酶C的受体)是由7个Trp-Asp40(WD40)高度保守的序列组成的分子量为36KD的蛋白。且RACK1蛋白从衣藻到人都是保守的。因为其与哺乳动物G蛋白异源三聚体β亚基有同源性，故又被称为GNB2L1，即鸟嘌核苷酸结合蛋白β2-样1。RACK1只能与激活的蛋白激酶C(PKC)相互作用，同时既可以作为PKC的锚定蛋白，还可以招募PKC或者其它蛋白如PDE4D5、Src来行使支架蛋白的功能。而RACK1七个β螺旋组成的空间结构为其调节蛋白与蛋白相互作用提供了多蛋白相互作用表面。RACK1在高等哺乳动物和人类的组织中广泛表达，包括脑、肝脏和肾等等，并且在生理方面发挥重要作用，例如：细胞的发育、细胞的生长、大脑的功能及免疫反应。此外，文献报道RACK1在人癌症中表达上调，例如肝癌、黑色素瘤、非小细胞肺癌、结肠癌等等(Pablo Lopez-Bergami，Conway Huang，Conway Huang，et al.Rewired ERK-JNKSignalingPathwaysinMelanoma.Cancer Cell 11，447-460，May 2007)。因此，RACK1很有可能作为新的肿瘤标志物被发现和应用，这将为肿瘤的早期诊断提供了一个新的途径。

文献报道，与正常肝细胞(Liver)相比，HCC(hepatocellular carcinoma)中JNK活性增强，即P-JNK水平升高。并且当敲掉JNK1时，小鼠肝平均肿瘤体积减少，说明JNK在肝癌形成中发挥着促瘤活性(Lijian Hui，Kurt Zatloukal，Harald Scheuch，et al.Proliferation of human HCC cells and chemically induced mouse liver cancers requires JNK1-dependent p21 downregulation.The Journal of Clinical Investigation，Volume 118 Number 12 December2008)。同时，RACK1在肝癌病人的表达中也呈现上调趋势(Katia Bourd-Boittin，He′Ie`ne Le Pabic，Dominique Bonnier，et al.RACK1，a New ADAM12 Interacting Protein.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRYVOL.283，NO.38，pp.26000-26009，september 19，2008)。我们前期工作表明RACK1与P-JNK有相关性，并且文献报道，PKC调节JNK活性依赖于RACK1的WD1-4结构域(Pablo López-Bergami，Hasem Habelhah，Anindita Bhoumik，et al.Receptor for RACK1 Mediates Activation of JNK by Protein Kinase C.Molecular Cell，Vol.19，309-320，August 5，2005)。同时，我们通过酵母双杂交方式筛出RACK1是MKK7的相互作用蛋白，而MKK7是JNK的上游激酶。因此，我们提出基于研究RACK1与MKK7相互作用位点为新型肝癌药物的研发提供新的靶位。