[发明专利]一种真菌表达载体及其构建和筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种真菌表达载体及其构建方法和筛选方法，具体涉及一种以酸性海藻糖酶基因（Acid trehalase gene）为筛选标记的真菌表达载体及其构建和筛选方法，属于生物技术领域。

背景技术

害虫防治是农业生产的重要组成部分，化学农药在防治有害生物和保障农业增产方面起了积极作用，但化学农药大量长期使用引起了一系列的环境和食品安全问题。由于微生物生物防治具有安全和可持续控制的优点，一直受到人们的广泛关注。杀虫微生物农药是利用昆虫病原微生物研制的一大类生物农药，真菌是昆虫病原微生物中最大的一个类群，在自然条件下由真菌致病死亡的昆虫约占全部病原微生物致病死亡的60%，是自然界控制昆虫种群数量的重要因素之一。与病毒、细菌的胃毒杀虫途径不同，真菌主要通过昆虫体壁侵染昆虫，真菌可侵染刺吸式口器的昆虫和非取食期的昆虫卵、蛹等；害虫难以对真菌制剂产生抗性；可离体进行大规模生产。与大多数化学农药相比，昆虫病原真菌对哺乳动物毒性低，对环境的影响可以忽略。真菌是最先被研制成杀虫剂的微生物，绿僵菌和白僵菌等杀虫真菌农药已用于松毛虫、玉米螟和蝗虫等害虫的防治，其中杀蝗绿僵菌制剂被联合国粮农组织推荐为环保型产品，国内外已登记60多种杀虫真菌农药，目前真菌杀虫剂已作为化学农药的替代产品或补充制剂防治多种有害昆虫。因此，昆虫病原真菌在害虫防治中具有十分重要的地位。然而，目前的杀虫真菌农药都是用野生菌株研制的，致病过程较长、杀虫较慢。因此，杀虫真菌农药的田间使用剂量大、成本高。杀虫慢、成本高的缺点限制了杀虫真菌的广泛应用，急需提高菌株毒力。

为克服野生菌株杀虫慢的缺点，人们开展杀虫真菌工程菌株的构建技术研究，并已取得有良好的进展。目前主要采用基因工程技术超量表达昆虫病原真菌的毒力基因显著提高杀虫活性，或者通过转杀虫毒素基因提高杀虫活性。组成性表达绿僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因（Pr1）的工程菌株毒力明显提高，致死时间缩短25%，取食量下降40%；组成性表达白僵菌几丁质酶基因的工程菌株对蚜虫的毒力明显增强，对蚜虫的致死剂量比野生菌株降低50%；由于该基因没有几丁质连接域，将家蚕的几丁质连接域与其融合后，组成性表达的工程菌株杀虫活性进一步提高。将昆虫特异性神经毒素AaIT基因置于昆虫血腔特异启动子的控制下转入绿僵菌，工程菌株对烟草天蛾和埃及伊蚊的杀虫速度分别提高28%和38%，致死中浓度（LC₅₀）分别下降约22倍和9倍，感染昆虫取食量下降50%；神经毒素只有在真菌穿透昆虫表皮后才能表达，进一步提高了工程菌株的安全性。

然而，目前国内外构建杀虫真菌工程菌株的筛选标记采用杀真菌剂抗性标记包括Benomyl抗性标记（β-tubulin基因），除草剂抗性标记（Bar基因），潮霉素抗性标记（hph基因），含有这些抗性筛选标记的基因工程菌（如含有除草剂抗性标记Bar基因的工程菌）作为生物农药进入自然环境中，一旦出现基因漂移如被自然界的杂草、植物病原真菌等微生物等吸收，则杂草会对除草剂出现抗性、病原微生物将会产生抗药性，将对环境和生态系统造成很大的影响，因此目前筛选标记的选择是制约杀虫真菌工程菌株广泛应用的重要影响因素。目前，国内外成功用于真菌转化的安全筛选标记尚未见报道。因此，迫切需要开展以安全筛选标记为核心的杀虫真菌工程菌设计与构建的新技术研究，为选育具有实用价值的安全、高毒力的杀虫真菌工程菌株提供良好的技术平台。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以酸性海藻糖酶基因作为筛选标记的安全、高效的真菌表达载体。许多真菌不能够直接利用海藻糖，因此它们在海藻糖为唯一碳源的培养基上生长缓慢，本发明的原理是将降解海藻糖的酸性海藻糖酶基因作为筛选标记构建在载体上，转入真菌后进行组成性表达；在海藻糖为唯一碳源的培养基上，转化子通过酸性海藻糖酶将海藻糖分解为葡萄糖，因而能够利用海藻糖并快速生长，得以筛选出来。

本发明的另一目的在于提供上述真菌表达载体的构建方法。

本发明的又一目的在于提供以上述真菌表达载体构建的转化子的筛选方法。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：