[发明专利]高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体及其制备

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体及其制备，属于生物技术领域。

背景技术

用杂交瘤细胞生产单克隆抗体(Monoclonal Antibody，McAb)是近些年来在免疫学和分子生物学领域中显著成就之一。单克隆抗体纯度高、专一性强，较常规的免疫学方法优越，为标准化提供了机会。单克隆抗体以其严格的识别特异性已渗透到科学研究的各个方面，在病原体的抗原分析、结构蛋白功能及其作用机理、疾病诊断的研究等方面得到了广泛的应用。

高致病性猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome，PRRS)是由PRRS病毒变异株引起的，该病以来势凶猛、发病突然、传播迅速、死亡率高、治愈率低为主要特点，尤其以保育猪、育肥猪的发病率较高，母猪发生流产，给养猪业带来极大的危害和重大的经济损失。目前对猪繁殖与呼吸综合征的检测技术主要有病毒分离、免疫过氧化物单层细胞试验(IPMA)、间接免疫荧光(IFA)、RT-PCR等方法，但检测所需时间长，成本昂贵。建立一种敏感、特异、快速、经济的检测手段势在必行，而获得特异性单克隆抗体为其提供了物质保障。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以生物技术手段纯化谷胱甘肽转移酶-GP5(GST-GP5)融合蛋白，制备抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的杂交瘤细胞株及其单克隆抗体，本发明的单克隆抗体敏感、特异性强，只对GP5蛋白有抗性，而对GST蛋白无抗性，为进一步建立特异、敏感、快速的PRRS病毒检测方法奠定了基础。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

本发明提供一株抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.4651。

本发明还提供了由保藏号为CGMCC No.4651的杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体，抗体亚型为IgA型。

本发明的单克隆抗体对GST-GP5融合蛋白有反应性，对GST没有反应性，对PRRS病毒GP5蛋白具有特异性反应。

本发明还提供了该单克隆抗体的制备方法，其制备过程如下：

根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白中第32-65个氨基酸和第127-200个氨基酸设计两对引物，并在引物中引入12个氨基酸，即：SGGRGGSGGRGG作为连接桥段，采用PCR的方法分别扩增高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白中第32-65个氨基酸基因序列及第127-200个氨基酸基因序列，这两段序列利用上述12个氨基酸作为连接桥段，连接成一个大片段；将上述连接片段产物酶切处理，克隆于携带GST的原核表达载体pGEX-6p-1中；测序鉴定，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)对其进行诱导表达，得GST-GP5融合蛋白；用纯化的GST-GP5融合蛋白免疫Balb/c雌性小鼠，取小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合，用间接ELISA方法进行筛选，用含GST标签的其它抗原筛选GST抗原，筛选出能够分泌对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白有反应性而对GST没有反应性的单克隆抗体的杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞上清液中或从注射杂交瘤细胞后的动物腹水中获取单克隆抗体。

其中，所述的两对引物序列为，第32-65个氨基酸的上游引物：TTCGAATTCAGCAACAACAACAGCTCTCAT，下游引物：GCCGCCGCGGCCGCCGCTGCCGCCGCGGCCGCCGCTCTCCACTGCCCAGTCAAA；第127-200个氨基酸上游引物：AGCGGCGGCCGCGGCGGCAGCGGCGGCCGCGGCGGCCTTGCGAAGAACTGC，下游引物：TCGCTCGAG GAGACGACCCCATTG。

本发明的单克隆抗体可用于制备猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒。

本发明的单克隆抗体可用于快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒。

本发明的单克隆抗体也可用于检测猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白。

本发明的抗高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株为申请人筛选得到，细胞株稳定，分类命名为抗PRRSV GP5蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，已于2011年3月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.4651。