[发明专利]一种利用人工染色体在乳腺中高效生产重组蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种利用人工染色体在乳腺中高效生产重组蛋白的方法。

背景技术

为了提高重组蛋白的表达水平，保证调控元件的完整性和克服“位置效应”是需要考虑的两个重要要素。目前，可行的解决方法有两种，一是通过基因打靶技术，使外源基因定点整合在染色体的特定位置，再通过体细胞核移植来生产转基因动物。该方法具有位点专一性强，可稳定遗传以及外源基因不受位置效应影响，对邻近基因也没有影响等优点。但是，大动物还没有获得有应用价值的干细胞，而普通体细胞的基因打靶技术却是一项非常艰难的工作，只是偶尔才能获得成功，原因在于体细胞能够传的代数非常有限，而且经药物筛选之后，细胞活力很差，用这样的细胞来进行核移植实验，胚胎发育率低。另外，中靶细胞不能得以有效扩繁，鉴定工作难以在细胞水平上开展。二是以大片段DNA为载体生产转基因动物。大片段DNA载体保证了目的基因上下游侧翼序列的完整性，可包含增强子、绝缘子和座位调控区(LCR)等重要调控元件，不但能消除或减弱基因整合后的“位置效应”，而且能在一种相对“自然”的环境中保证外源基因的有效表达。因此，大片段DNA载体极有可能成为转基因的发展趋势。

目前，报道过生产出转基因动物的大片段DNA载体主要有酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)及P1染色体(PAC)等。在这三种大片段DNA载体中，BAC作为转基因载体具有无可比拟的优点，可作为首选。首先BAC为环形质粒，可用氯霉素筛选，操作起来比YAC简单；其次，BAC复制子来源于单拷贝质粒F因子，其在宿主菌内只有极少数拷贝，可稳定遗传，无缺失、重组和嵌合现象，可重复操作多次而不会产生突变；第三，BAC载体是全基因组测序的常用文库，其数量随着全基因组测序的发展而迅速增加，购买极为方便。1999年，Stinnakre等用山羊α-乳清蛋白BAC生产了转基因小鼠，结果重组蛋白克服了“位置效益”，得到了高效表达，并且表达量和拷贝数呈线性关系。但是，由于技术的欠缺，人们很难对BAC进行操作，更不可能用整个BAC去调控某个外源基因的表达。

操作大片段DNA载体依赖于重组技术(Recombineering)的发展，其分为四个发展阶段，RecBCD缺陷介导的重组、RecA介导的重组、RecET重组系统和Red重组系统，其中以Red重组系统最为方便和高效。Red重组系统能够表达3种噬菌体同源重组蛋白：exo、beta和gam，其中gam蛋白能够抑制RecBCD蛋白的外切酶活性，阻止外源双链DNA的降解；exo蛋白则具有5’→3’的核酸外切酶活性，能够将线性片段的双链DNA从5’端切开，形成3’单链突出末端；beta蛋白能够与3’单链突出末端结合，促进单链与同源序列间的退火，实现线性DNA片段和目标序列间的同源重组。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用人工染色体在乳腺中高效生产重组蛋白的方法，其可以保证调控元件的完整性和克服“位置效益”，大幅提高外源基因的表达量，提高育种成功率。

为了实现本发明目的，本发明的一种利用人工染色体在乳腺中高效生产重组蛋白的方法，其是采用重组技术将外源基因完整替换哺乳动物的乳腺特异表达蛋白的人工染色体上的靶基因，使外源基因获得完整的乳腺高效表达靶基因的调控序列，将获得的重组人工染色体转入哺乳动物中，从而使外源基因在动物乳腺中高效表达。

前述的方法，所述人工染色体为酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1染色体(PAC)等，优选BAC。

前述的方法，所述外源基因为人溶菌酶基因、人胆盐激活脂酶或丁酰胆碱酯酶等。

前述的方法，所述外源基因采用基因组序列。

前述的方法，所述乳腺特异表达蛋白为as1-酪蛋白、β-酪蛋白、β乳球蛋白、兔或小鼠乳清酸蛋白等。

前述的方法，所述哺乳动物为牛、羊、兔、小鼠等。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

根据本发明的一个优选实施方式，采用重组技术将人溶菌酶基因完整替换人乳铁蛋白BAC上的靶基因，得到了一种根据上述方法构建的高效表达载体，其具有如图1所示的pBAC-hLF-hLZ-Neo载体结构。其可以在牛乳腺中高效表达生产人溶菌酶。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(1)本发明的一种利用人工染色体在乳腺中高效生产重组蛋白的方法，可以保证调控元件的完整性和克服“位置效益”，大幅提高外源基因的表达量，提高育种成功率。