[发明专利]一种在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，涉及一种在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法。

背景技术

抗菌肽是动植物体内分泌的一类小分子活性多肽，一般由15-45个氨基酸组成，在动植物的免疫系统中发挥着重要作用。目前，由于抗生素的滥用导致耐药菌株不断增多，人们对抗菌肽的研究投入极大热情。

家蚕抗菌肽属于Cecropin家族中的一个成员，为线性、d-螺旋肽，含有35个氨基酸；抗菌肽具两亲性：N端具有亲水性、C端具有疏水性，同时抗细菌、抗真菌及抗肿瘤作用，且对正常真核细胞无明显毒副作用。

抗菌肽CM4是张双全等从中国家蚕(Bombyx mori)(浙农1号×苏12号)中分离得到的。它是线性的、具有α螺旋两亲的阳离子肽，由35个氨基酸组成，分子量约为3.8KD，有很强的杀菌能力，对细菌，真菌等都有作用且不含甲硫氨酸。从蚕蛹中提取的执菌肽CM4具有较广泛的抗菌和杀伤某些肿瘤细胞的能力，并且不破坏正常细胞。目前已有在大肠杆菌表达系统、毕赤酵母表达系统中表达抗菌肽CM4的报道，但至今尚未有在昆虫细胞中表达抗菌肽CM4的相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

在昆虫细胞sf9中表达抗菌肽的方法，包括如下步骤：

1)将两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的抗菌肽CM4基因克隆入pFastBacHT B载体的BamHI/HindIII位点间得到重组质粒pFastBac HTB-ABP；

2)将重组质粒pFastBac HTB-ABP转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，与其中的杆状病毒穿梭载体Bacmid重组，获得插入ABP基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP；

3)脂质体介导重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP转染Sf9昆虫细胞，获表达抗菌肽的重组病毒；

4)培养所述的重组病毒，表达抗菌肽CM4。

其中，步骤1)所述的两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的抗菌肽CM4基因通过如下方法获得：以中国家蚕(Bombyx mori)(浙农1号×苏12号)的总RNA为模板，利用上游引物sABP-F：SEQ ID NO.1，下游引物sABP-R：SEQ ID NO.2通过rPCR扩增得到所述的抗菌肽CM4基因；然后以所述的抗菌肽CM4基因为模板，利用上游引物pFastBacHTB-F：SEQID NO.3，下游引物pFastBacHTB-R：SEQ ID NO.4通过PCR扩增得到两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的抗菌肽CM4基因。

本方法还包含所述的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP的鉴定。

所述的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP的鉴定方法优选PCR鉴定：分别以M13-F：SEQ ID NO.5、M13-R：SEQ ID NO.6和M13-F：SEQ ID NO.5、pFastBacHTB-R：SEQ ID NO.4以及pFastBacHTB-F：SEQ ID NO.3、M13-R：SEQ ID NO.6为引物对重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP进行PCR扩增，能够扩增出对应的2471bp、1876bp、740bp目标片段的即为真正含有整合了目的基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP。

所述的重组病毒培养基为无血清无抗生素的Sf-900II SFM。

有益效果：

发明人参照CM4序列合成了昆虫细胞偏爱密码子的引物，进而将CM4克隆入pFastBacHTB载体，并进一步获得含ABP基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-ABP，通过脂质体介导转染Sf9昆虫细胞，成功实现了抗菌肽CM4基因在昆虫细胞中的表达，为抗菌肽CM4的大量获得提供一条新途径，为进一步的抗菌机理的研究及新药的开发打下工作基础。

本发明首次实现了在昆虫细胞中表达抗菌肽CM4基因，与在毕赤酵母中表达CM4比较的积极作用：

1.在昆虫中表达家蚕抗菌肽CM4，由于与家蚕的种属相近，有望得到后加工完整、生物活性高的CM4；

2.只要获得高滴度的重组CM4的杆状病毒，可直接感染昆虫细胞，易于纯化，易于大规模生产外源蛋白。

附图说明

图1、CM4基因PCR扩增产物；

1：CM4 gene(105bp)，M：Marker 2000。