[发明专利]冬凌草甲素在制备获得免疫抑制效应药物中的应用

说明书

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，尤其涉及一种冬凌草甲素在制备获得免疫抑制效应药物中的应用。

背景技术

冬凌草甲素作为一种从传统中药冬凌草中分离提取而来的贝壳杉烯二萜类天然有机化合物，是冬凌草发挥抗肿瘤作用的主要成分。体外药效学研究表明浓度在15-35μmol/L之间的冬凌草甲素能诱导多种癌细胞如HPB-ALL、Hela、A375-S2、Bel-7402、U937、U20S、MG63、SaOS-2等的凋亡，但不能诱导人纤维细胞和外周血单个核细胞的凋亡。冬凌草甲素对CD19+B细胞和CD3+T细胞的生存没有作用，但对PBMC杀伤作用较弱，尽管PBMC拮抗冬凌草甲素的细胞毒作用，但在34.3μmol/L的冬凌草甲素作用24小时时，PBMC的生长受到抑制，由12小时细胞存活率的87％降至75％左右，可见冬凌草甲素对PBMC的细胞毒作用与5-氟尿嘧啶相当。河南省医学科学研究所等单位发现冬凌草甲素对雄性小鼠体液免疫功能有轻度抑制作用，对细胞免疫无明显抑制作用。经检索，关于冬凌草甲素抑制PBMC，还能诱导淋巴细胞亚群CD4+T，CD8+T，NK细胞的凋亡，对机体免疫系统产生影响的专利或研究文献还未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种冬凌草甲素在制备获得免疫抑制效应药物中的应用。

本发明所述冬凌草甲素在制备获得免疫抑制效应药物中的应用，其特征在于：所述获得免疫抑制效应以冬凌草甲素诱导外周血淋巴细胞凋亡的方式实现。

其中：所述获得免疫抑制效应以冬凌草甲素抑制人PBMC，诱导淋巴细胞亚群CD4+T，CD8+T或NK细胞凋亡的方式实现。

其中：所述冬凌草甲素抑制人PBMC，诱导淋巴细胞亚群CD4+T，CD8+T或NK细胞凋亡的浓度为6～18μmol/L，作用时间为48～60小时。

进一步的，上述冬凌草甲素抑制人PBMC，诱导淋巴细胞亚群CD4+T，CD8+T或NK细胞凋亡的浓度优选6～12μmol/L，作用时间优选48小时。

为了更好地理解本发明的实质，下面用冬凌草甲素体外诱导免疫抑制和体内诱导免疫抑制的药理实验及免疫抑制效果来说明冬凌草甲素在制备获得免疫抑制效应药物中的应用。

体外诱导免疫抑制的方法

浓度为6～18μmol/L的冬凌草甲素体外作用于正常人PBMC 48小时，台盼蓝染色后显微镜下计数发现活细胞数目随药物浓度增加而逐渐减少，死细胞数目在一定程度上明显增加。不同浓度的冬凌草甲素对PBMC生长产生抑制作用，细胞存活率逐渐降低，并且与药物浓度成明显的效用关系。

浓度为6～18μmol/L的冬凌草甲素体外作用于正常人PBMC 48小时出现由亚G0/G1期形成的凋亡峰，该期细胞数占检测细胞的百分比，即为细胞发生凋亡的比例，亚G0/G1期峰随着药物浓度的增加而逐渐明显，提示PBMC凋亡显著。随浓度的升高，PBMC凋亡率也升高。

浓度为6～18μmol/L的冬凌草甲素体外作用于正常人PBMC亚群48小时后，CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK细胞表现为明显的凋亡现象，B细胞主要表现为坏死。

体内诱导免疫抑制的方法：

雄性小鼠C57BL/6连续注射冬凌草甲素10mg/kg 3天，第五天时分别从血液，肝脏，脾脏中分离淋巴细胞，检测三种来源的细胞的凋亡率。从脾脏中分离淋巴细胞亚群CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、NK细胞等，进而检测细胞的凋亡。

免疫抑制效果的检测

收集对照组及药物诱导48小时PBMC细胞，用PBS洗两次，70％预冷乙醇固定过夜。PBS洗2次，加入碘化丙啶(PI)染液(0.1％Triton X-100，200μg/ml DNase-Free RNase A，20μg/ml PI，all in PBS)200μl，37℃避光15min。上流式细胞仪进行细胞周期和凋亡峰检测。

收集药物诱导48小时PBMC细胞，PBS洗两次，分别加入区分淋巴细胞亚群的单抗或相应同型对照抗体，混匀后4℃避光孵育30min，PBS洗两次，再分别加入Annexin V 1μl，室温避光孵育20min，再加入PI染液(100μg/μl)0.5μl，避光反应5min后，加入BindingBuffer 200μl重悬细胞，立即用FACS Calibur流式细胞术定量检测。以FSC/SSC二维散射光图确定淋巴细胞群体，统一进行标准化设门。

结果