[发明专利]肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部融合蛋白改构体快速筛选方法及其应用

说明书

 技术领     域本发明属于生物技术领域，为基因工程重组蛋白的应用。具体涉及肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部融合蛋白及其基因的人工重组改构和密码子优化，以期获得该重组蛋白更好的生物学效应、更高的稳定性及在哺乳动物细胞中更高效的表达产量。为此，本发明同时建立了一种利用腺病毒载体/BHK21细胞系统来表达改构体的方法。目的是将其做为一种技术手段，以便于快速筛选出活性更高、结构更稳定的肿瘤坏死因子受体Ⅱ-脂联素球部融合蛋白的各种改构体。

 背景技     术类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)作为危害人类健康最常见、最难治愈的免疫疾病之一，严重影响着患者的生活质量，是造成我国人群丧失劳动力和致残的主要病因。我国现有该病患者2000万人，包括中重度活动性患者约400多万。类风湿性关节炎至今尚无特效疗法，传统的综合治疗方法针对炎症及后遗症采取措施缺乏显著疗效，并且长期使用易引起严重的副作用。临床表现为多处关节滑膜炎持久反复发作，可导致关节内软骨和骨的破坏，关节功能障碍，甚至残废。该病在世界范围内普遍存在，其发病率约占人群的1％-2％。因此，类风湿性关节炎已成为危害人类健康最常见、最难治的疾病之一(Toussirot E and Wendling D.The use of TNF-alpha blocking agents in rheumatoid arthritis：an update.Expert Opin Pharmacother.2007，8(13)：2089-2107)。

研究发现，TNFα在类风湿性关节炎的发生中起着重要作用。如：过度表达TNFα的转基因小鼠会发生侵蚀性、炎性关节炎(Keffer J，Probert L，Cazlaris H，et al.Transgenic mice expressing human tumour necrosis factor：a predictive genetic model of arthritis.EMBO J.1991，10(13)：4025-4031)；在RA的动物模型中，胶原诱发的关节炎、佐剂诱发的关节炎等，用TNFα阻滞剂治疗可明显减轻关节的炎症与破坏；在RA患者的滑液中发现TNFα的表达量高于正常人等等(Saxne T，Jr Palladino MA，Heinegard D，et al.Detection of tumor necrosis factor alpha but not tumor necrosis factor beta in rheumatoid arthritis synovial fluid and serum.Arthritis Rheum.1988，31(8)：1041-1045.)。因此去除过多的TNFα成为治疗类风湿性关节炎的目标之一(Brennan FM，Chantry D，Jackson A，et al.Inhibitory effect of TNF alpha antibodies on synovial cell interleukin-1 production in rheumatoid arthritis.Lancet.1989，2(8657)：244-247)。

TNFα拮抗剂作为治疗类风湿性关节炎的新型药物在缓解疼痛、改善和维持关节功能上有着明显的功效，得到了医学界的广泛重视，已成为目前治疗该病的研究热点。目前已开发的TNFα拮抗剂主要有Infliximab、Adalimumab和Etanercept三种(Landry Y and Gies JP.Drugs and their molecular targets：an updated overview.Fundam Clin Pharmacol.2008，22(1)：1-18)。其中Infliximab为嵌合性的抗TNFα抗体，Adalimumab为人源化的抗TNFα抗体，这两种抗体均能分别与TNFα结合，并均能因此中和TNFα而获得拮抗TNFα的作用。而Etanercept为TNFα的受体，也能与TNFα结合，产生拮抗TNFα的作用。