[发明专利]原生质体不对称融合制备抗霜霉结球甘蓝新种质的方法

说明书

 

技术领域

本发明属于农业生物技术工程，具体来说涉及一种原生质体不对称融合创制抗霜霉病结球甘蓝新种质的育种途径。

背景技术

甘蓝类蔬菜包括结球甘蓝、花椰菜、绿菜花、球茎甘蓝、芥蓝、抱子甘蓝、羽衣甘蓝等，是我国人民喜爱并广为栽培的主要蔬菜类群之一。甘蓝霜霉病是由专性寄生菌寄生霜霉引起的一种世界性病害，这种真菌性病害常引起幼苗和成株叶片枯黄，导致产量降低，品质下降，给甘蓝生产上带来极大的损失。而且，目前生产上基本没有对霜霉菌高抗甚至免疫的结球甘蓝品种，所以选育抗霜霉病的结球甘蓝品种迫在眉睫。

在长期自然选择下，抱子甘蓝有许多对病虫害具备高度抗性以至免疫力，要利用这些抗性基因，一个方法是克隆基因，并通过基因工程手段导入目标材料中。但是许多抗病性是受多基因控制，仅分离、导入一个基因，转基因材料获得的抗病性常不理想。而且，对于抗性基因的分析、定位、克隆和转化存在着技术难度大，周期长，投资高，以及市场的准入和接受程度等问题。另一个方法可以通过有性杂交的手段，向栽培品种引入抗性基因，但是物种间的生殖隔离使常规的有性杂交非常困难甚至不可能。借助非对称体细胞融合技术可以克服通过基因工程手段获得抗病品种遇到的难题，而且也避免了常规育种方法中远缘杂交不亲和的问题，同时与对称融合相比，由于形成的杂种中一般只含有供体的部分染色体，因此在提高杂种的育性及缩短育种年限等方面具有一定的优势。非对称体细胞融合技术实现不同物种间的抗性基因转移，是进一步创造新的育种基础材料的有效途径。

在芸薹属作物中，Kartha等（1974）首次培养油菜叶肉原生质体再生植株后，直到80年代中期才在甘蓝、芥菜、芥蓝、大白菜上取得突破，培养技术日趋完善。采用原生质体融合形成异源四倍体、创造新型胞质或核质组合、转移人们感兴趣的远缘物种染色体片段或基因等方面也取得了很大的成绩。如邓秀新研究组（1997）通过柑桔体细胞杂交获得抗寒、抗高温和抗病的杂种后代，夏光敏等（2006）利用不对称体细胞杂交技术将近源植物的染色体小片段导入小麦体细胞中，创制耐盐、抗旱、高产、优质小麦新种质及新品种。所以采用非对称体细胞融合创制抗霜霉病结球甘蓝新种质是一条可行的、科学的途径，对于获得新的抗病种质，以及利用这些种质培育新的抗病品种具有长远的意义。

发明内容

解决的问题：

本发明是针对上述情况，利用通过聚乙二醇（PEG）介导的非对称原生质体融合，将抱子甘蓝的抗寄生霜霉基因转入具有优良性状的感病结球甘蓝中，得到具有抗霜霉病的优良结球甘蓝新种质，用于结球甘蓝霜霉病抗性育种。

技术方案：

原生质体不对称融合制备抗霜霉结球甘蓝新种质的方法，其特征在于所述携带抗霜霉病基因的抱子甘蓝为供体，供体原生质体经过UV射线处理；感霜霉病的具有其他优良经济和农艺性状的结球甘蓝为受体，通过原生质体融合途径创制抗霜霉病结球甘蓝新种种质，该新种质是采用下述方法得到的：

（1）首先将收集的结球甘蓝霜霉病菌通过苗期人工接种，筛选获得抗十字花科霜霉病的抱子甘蓝基因型，作为抗性基因供体材料，其中该霜霉病菌是十字花科霜霉菌；

（2）受体结球甘蓝原生质体的制备：采用酶解法分离和纯化易感霜霉病结球甘蓝的下胚轴原生质体，获得受体结球甘蓝原生质体；

（3）供体抱子甘蓝原生质体的制备：采用酶解法分离和纯化抗霜霉病抱子甘蓝的叶肉原生质体，获得供体抱子甘蓝原生质体；

（4）利用0.075 J·cm^-2 UV射线处理上述的供体抱子甘蓝原生质体；

（5）用预融合液分别调整供体抱子甘蓝原生质体、受体结球甘蓝原生质体的浓度至2×10⁶个·ml^-1，按1:1 的比例均匀混合得到原生质体悬液，将原生质体悬液用40％聚乙二醇融合液融合得到融合产物；

（6）融合后原生质体的培养及不定芽诱导，杂种植株再生，得到抗霜霉结球甘蓝新种质B1011：植株开展度45 cm左右，外叶深绿，叶柄长，蜡粉中，外叶数12片，叶球圆，球色绿，球叶厚，中心柱短，单球重0.7 kg，高抗霜霉病，自交亲和，配合力好 。