[发明专利]人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列，及其在制备HIV免疫原中的应用，在制备预防和治疗性HIV疫苗中的应用，在制备HIV检测试剂盒中的应用。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)主要经血液、性接触及母婴垂直途径等传播，可引起获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，即艾滋病。据联合国艾滋病规划署2009年底新的统计，目前全球HIV感染者约6000万，2500万人死于艾滋病相关疾病。我国现存HIV感染者和艾滋病病人约70多万，其中70％以上为性接触传播，艾滋病已经成为我国及全球所面临的重大公共卫生问题。目前采用高效抗逆转录病毒疗法(HAART)虽能延缓艾滋病病情的发展，但不能完全清除病毒；行为干预也仅减缓HIV感染传播速度而无法终止其流行。因此，迫切需要开发研制新的有效的药物以控制HIV的传播和感染。感染人类的HIV有HIV-1和HIV-2两型，两者核苷酸序列相差可超过40％。世界各地主要流行的是HIV-1，HIV-2则主要流行在非洲西部地区。

HIV-1转录反式激活因子(trans-activator of transcription，Tat)是HIV-1感染早期产生的重要调控蛋白。根据HIV-1毒株的不同，Tat蛋白由86-101个氨基酸残基组成，由两个独立的外显子编码：第1个外显子编码1-72位氨基酸(aa)，具有完全的转录激活活性；第2外显子编码Tat C末端区(73-101aa)。试验证实Tat在HIV-1复制、扩散及致病中起重要作用。研究表明，在感染细胞内，Tat可反式激活HIV基因组转录的起始和延长，从而启动和促进病毒的复制；而分泌和释放至细胞外的Tat还具有多样的胞外活性，如参与免疫抑制、神经系统损伤及Kaposi肉瘤形成等致病过程，被称为“病毒毒素”(参见文献：Silvers JM，Aksenova MV，Aksenov MY，Mactutus CF，Booze RM.Neurotoxicity of HIV-1Tatprotein：involvement of D1 dopamine receptor.Neurotoxicology.2007；28(6)：1184-1190.)。Tat上述生物学特性及致病效应已使其成为HIV预防性及治疗性疫苗的候选抗原之一。

HIV-1Tat分子为天然非折叠蛋白，属于无规卷曲类型的分子。虽然Tat序列在HIV-1不同亚型间具有高度保守性，但其缺乏稳定二级结构和高级结构，使其分子构象极不稳定，处于快速动态的变化之中。上述HIV-1 Tat分子本身的序列及结构特征，使得天然Tat作为HIV疫苗的候选抗原尚存在诱发免疫保护性抗体滴度低、交叉反应性差等不足。因此通过分子生物学手段，对HIV-1天然Tat分子结构进行改造，是获得分子构象相对稳定的新型Tat免疫原的一条有效途径，具有潜在的HIV疫苗开发价值。

发明内容

本发明的目的在于制备构象相对稳定并能诱导产生更强免疫反应的新型HIV Tat免疫原。

本发明通过对人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)HXB2株天然Tat(参见文献：Opi S，Péloponèse JM Jr，Esquieu D，Campbell G，de Mareuil J，Walburger A，Solomiac M，Grégoire C，Bouveret E，Yirrell DL，Loret EP.Tat HIV-1 primary andtertiary structures critical to immune response against non-homologous variants.JBiol Chem.2002；277(39)：35915-35919.)分子不同区段进行合理截取，即取Tat1-37、Tat1-61和Tat22-101区段分别构建原核表达质粒，经过转化大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)，用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)诱导表达，以及经SDS-PAGE凝胶电泳分析和Western b1ot鉴定，筛选获得三种构象相对稳定并能诱导产生更强免疫反应的新型HIV-1Tat免疫原，本发明制备获得的HIV-1Tat免疫原在国内外未见报道。

本发明提供了以下三种人类免疫缺陷病毒I型Tat蛋白突变体序列：