[发明专利]获得流感样本中流感病毒核酸的方法及其专用引物

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中获得流感样本中流感病毒核酸的方法及其专用引物。

背景技术

在历史上有很多种瘟疫给人类带来大量死亡和深重灾难。近百年来，由于医学科学的发展和进步，大多数瘟疫得到了控制，唯独流感，人类还没有找到制服它的有效途径和方法。

流感病毒属于正黏病毒科，有甲型、乙型与丙型流感病毒三个属。流感病毒因其具有较强的传染性，被认为是影响公共卫生安全的重要危险因素，其中以甲型流感危害最为严重。特别是2009年3月于墨西哥发现、并在世界范围内引起广泛传播的新甲型流感病毒(swine H1N1)的暴发流行，更加重了人们对于流感病毒传播的担忧。

流感由于其不断变异而造成周期性流行，其中变异最为明显的就是甲型流感病毒。该病毒抗原变异后，传染性大，传播迅速，易发生大范围流行。因此，研究病毒抗原性、致病性和耐药性变异，分析新型流感流行病学规律、临床特征、追踪严重程度变化，科学评估流感大流行风险，对全球依法科学规范有序地防控流感大流行具有重要意义。

为了及时了解流感病毒的流行和变异情况，开展以实验室监测是必要的手段。但是，在实验室进行流感监测中，如果采用细胞进行病毒分离的方法进行实验室监测，不但周期长而且对新发生的流感变异株需要更高的实验条件。这些因素造成了流感病毒分离的周期增加。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于扩增流感病毒核酸的引物对。

本发明所提供的用于扩增流感病毒核酸的引物对，由序列表中序列9所示的引物和序列表中序列10所示的引物组成。

所述流感病毒为甲型流感病毒。

所述甲型流感病毒为甲型H3N2亚型流感病毒。

本发明的另一个目的是提供获得流感病毒核酸的方法。

本发明所提供的获得流感病毒核酸的方法，包括以下步骤：

以感染流感病毒的样本的总RNA为模板，用所述引物对进行RT-PCR扩增，得到RT-PCR扩增产物，即得到所述流感病毒的核酸。

所述流感病毒为甲型流感病毒。

所述甲型流感病毒为甲型H3N2亚型流感病毒。

所述样本为临床流感样病例的咽拭子。

所述RT-PCR扩增的反应条件如下：42℃60分钟；94℃预变性2分钟；然后按照下列参数进行5次循环：94℃变性30秒，45℃复性30秒，68℃延伸3分钟；再按照下列参数进行35次循环：94℃变性30秒，57℃复性30秒，72℃延伸3分钟；循环反应结束后在68℃保持7分钟。

所述获得流感病毒核酸的方法在制备流感疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。

所述获得流感病毒核酸的方法在筛选预防和/或治疗流感的药物中的应用也属于本发明的保护范围。

通过本专利的方法，不用进行病毒分离工作直接从临床样本的核酸提取物中扩增流感病毒的基因组，大大简化流感病毒基因研究的程序、节省实验成本。基于本方法，通过设计流感病毒的片段扩增引物，能够直接成功扩增出流感病毒的所有片段。

附图说明

图1为临床样品(具体为咽拭子)中流感病毒核酸的RT-PCR扩增结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、扩增甲型H3N2亚型流感病毒核酸

实验设备和仪器：0.2ml PCR反应管或96孔或384孔反应板；20μl和200μl可调节移液器及滤芯枪头；无菌、无核酸酶的1.5ml微量离心管；一次性无粉手套；微量离心机或反应板离心机；漩涡振荡器；PCR仪(ABI 9700PCR仪)。

工作准备：工作台、移液管、离心机必须清洁，用去污剂净化，例如用5％的漂白剂、DNAzap^TM或者RNase来减小核酸交叉污染的风险。

1、样本采集

取临床上已初步确认为感染甲型H3N2亚型流感病毒的流感样病例的咽拭子进行实验，临床样本的获得均经过患者同意。以甲型H3N2亚型流感疫苗株A/Perth/16/2009(H3N2)(购自中国疾病预防控制中心)为阳性对照。阳性对照的病毒核酸为已知的，其基因组序列为Genbank number GQ902806.1(PB2)、FJ913004.1(PB1)、CY044513.1(PA)、FJ912976.1(HA)、CY038866(NP)、HQ615653.1(NA)、CY080548.1(M)和GU907116.1|(NS)。