[发明专利]检测恩诺沙星的scFv抗体、其编码基因及应用

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学检测领域，具体地说，涉及一种检测恩诺沙星的scFv重组抗体、其编码基因及应用。

背景技术

恩诺沙星(Enrofloxacin，ENRO)，化学名称为1-环丙基-7-(4-乙基-1-哌嗪基)-6-氟-1，4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸，属于氟奎诺酮类，具广谱抗菌活性，对支原体有特效，对大肠杆菌、克雷白杆菌、沙门氏菌、变形杆菌、绿脓杆菌、嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、溶血性巴氏杆菌、金葡菌、链球菌等都有杀菌效用。

恩诺沙星可作为动物用药品，在动物体内的半衰期长，有良好之组织分布性，属于广效性抑菌剂，对于革兰氏阳性菌、阴性菌及霉浆体具有抑菌作用。它作为一种常用兽药在畜牧业生产中得到广泛使用。但因其具有一定的毒性，在动物性食品中的残留对食品卫生和公共健康产生威胁。

检测恩诺沙星残留的方法主要有仪器分析法和免疫学方法。化学分析方法因需要昂贵的仪器设备、对样品前处理要求高，且需要配备专门操作人员等，不适合现场监控检测。免疫学方法，目前主要是Elisa(酶联免疫吸附)方法，但该方法的核心试剂-单克隆抗体，因其制备和筛选过程繁琐，并对操作技术要求很高，故其广泛运用受到了很大限制。

综上，本发明人提出了运用噬菌体展示技术制备抗恩诺沙星的scFv重组抗体，并以此建立检测恩诺沙星残留的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测恩诺沙星的scFv抗体及编码该抗体的基因序列及氨基酸序列。

本发明的另一目的是提供上述scFv抗体及其编码基因在检测恩诺沙星中的应用。

为了实现本发明目的，本发明人运用噬菌体展示技术，将小鼠抗体的重链、轻链可变区基因进行体外扩增，并借助了15肽的连接肽段将重链和轻链片段拼接成一条单链抗体scFv，接着将该scFv片段插入噬菌体展示载体pCANTAB5e中，构建成重组质粒，并转化进宿主菌中，经过3轮固相淘筛和鉴定，获得了抗恩诺沙星的scFv单链抗体。其包括重链和轻链，其中，重链和轻链的氨基酸序列分别如SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示。

前述的scFv抗体，重链和轻链之间的连接肽段为(Gly₄Ser)₃。

本发明还提供编码上述scFv抗体的基因，其中，编码scFv抗体重链的基因具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，编码scFv抗体轻链的基因具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

本发明还提供含有编码上述scFv抗体的基因的载体。

本发明还提供含有上述载体的宿主细胞。

本发明进一步提供上述scFv抗体、编码该抗体的基因、含有所述基因的载体或含有该载体的宿主细胞在检测恩诺沙星中的应用。

本发明还提供上述scFv抗体的制备方法，其是将编码上述scFv抗体的基因构建至表达载体中并转化宿主细胞，然后进行蛋白的表达及分离纯化。其中，所述表达载体为pCANTAB5e。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明检测恩诺沙星的scFv抗体，主要采用竞争性Elisa方法定性或定量检测样品中恩诺沙星的残留量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品；采用高特异性的恩诺沙星scFv抗体，主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量检测。能简便、高效地运用本发明获得的能分泌表达抗恩诺沙星重组抗体的重组菌株制备特异性的抗恩诺沙星scFv重组抗体。

附图说明

图1A和图1B：scFv-pCANTAB5e重组质粒sfiI和NotI双酶切电泳图，M：DL2000核酸分子量Marker，1～20：scFv-pCANTAB5e酶切产物。

图2：为30个重组菌诱导表达产生可溶性抗体scFv-ELISA检测结果。

图3：重组菌诱导表达产物SDS-PAGE电泳图，1：阴性对照，2：重组菌诱导表达胞周间质，3：重组菌诱导表达上清液，4：重组菌诱导表达全细胞提取物。

图4：恩诺沙星诱导表达上清可溶性重组抗体IC₅₀实验结果曲线图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中使用的试剂盒材料均为市售商品。

实施例1免疫原及检测原的偶联制备

1、材料