[发明专利]一种微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法

权利要求书

1.一种微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述方法是以乙酰乙酸叔丁酯为底物，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，进行转化反应制得所述(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯。

2.如权利要求1所述的微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述的方法为：反应体系以pH 5.0～8.0的磷酸盐缓冲液为反应溶剂，以乙酰乙酸叔丁酯为底物、以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No.2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，于25～45℃下转化反应8～40小时，反应结束后，转化液经分离纯化得到所述(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯。

3.如权利要求1所述的微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述的乙酰乙酸叔丁酯在反应体系中的初始终浓度为1～100mmol/L。

4.如权利要求1所述的微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述的反应体系中还添加有终浓度为5～20％的乙醇作为辅助底物。

5.如权利要求1所述的微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述的含酶菌体细胞用量以细胞干重计为1～20g/g乙酰乙酸叔丁酯。

6.如权利要求1所述的微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述的含酶菌体细胞按照以下方法制备：将酿酒酵母CGMCC No.2266接种至发酵培养基中，摇床转速为150～200r/min，26～35℃下培养18～30h，将发酵液离心，制得含酶菌体细胞。

7.如权利要求1所述的微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述的(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯分离纯化方法如下：反应结束后，将转化液4000r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分，抽滤，取滤液蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯。

8.如权利要求1所述的微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述的方法按照以下步骤进行：(1)斜面培养：将酿酒酵母CGMCCNo.2266接种到斜面培养基，26～35℃培养4～6天得菌体斜面；(2)种子培养：从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基，摇床转速为150～200r/min，26～35℃培养18～26h得种子液；(3)发酵培养：取种子液，以体积分数10～20％的接种量接种于发酵培养基中，摇床转速为150～200r/min，26～35℃培养18～30h，将发酵液离心分离得到所述含酶菌体细胞；(4)生物转化：在pH 5.0～8.0的磷酸盐缓冲液中，添加终浓度为5～20％的乙醇作为辅助底物，加入终浓度为1～100mmol/L的乙酰乙酸叔丁酯为底物，以及相当于细胞干重质量为乙酰乙酸叔丁酯1～20倍的含酶菌体细胞，25～45℃下转化反应8～40小时，反应结束制得转化液；(5)分离纯化：转化反应结束后，将转化液于4000r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分，抽滤，滤液蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯。

9.如权利要求1所述微生物转化制备(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：

(1)斜面培养：将酿酒酵母CGMCC No.2266接种到斜面培养基，26～35℃培养4～6天得菌体斜面；所述的斜面培养基终浓度组成为：麦芽汁5～15g/L，酵母粉2～4g/L，蛋白胨4～6g/L，葡萄糖7～12g/L，琼脂15～25g/L，自然pH值，溶剂为水；

(2)种子培养：从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基，26～35℃，摇床转速为150～200r/min，培养18～26h得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为：葡萄糖26～32g/L，酵母粉2～4g/L，硫酸铵3～6g/L，无水MgSO₄0.2～0.4g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5～1.5g/L，KH₂PO₄0.6～1.5g/L，用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7.0，溶剂为水；

(3)发酵培养：取种子液，以体积分数为10～20％的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为26～35℃，摇床转速为150～200r/min，培养18～30h得到含有含酶菌体细胞的发酵液，离心分离得到所述含酶菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖26～32g/L，酵母粉2～4g/L，硫酸铵3～6g/L，无水MgSO₄0.2～0.4g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.5～1.5g/L，KH₂PO₄0.6～1.5g/L，用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7.0，溶剂为水；

(4)生物转化：在pH 5.0～8.0的磷酸盐缓冲液中，加入终浓度为1～20mmol/L的乙酰乙酸叔丁酯为底物，添加终浓度为5～15％的乙醇作为辅助底物，以及相当于细胞干重质量为乙酰乙酸叔丁酯1～10倍的含酶菌体细胞，于25～45℃下转化反应8～40小时得转化液；

(5)分离纯化：反应结束后，将转化液于4000r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分，抽滤，取滤液蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羟基丁酸叔丁酯。