[发明专利]一种检测多种蛋白的电化学免疫分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种检测多种蛋白的电化学免疫分析方法，特别涉及一种可同时检测胃泌素前体释放肽和神经化烯醇酶的电化学免疫分析方法。

背景技术

肺癌的发病率和死亡率一直位居全球首位，并呈逐年增多的趋势。目前用于肺癌辅助诊断的血清肿瘤标志物的检测由于取样简单、易于接受等特点，在肿瘤筛查、诊断、评价治疗疗效等方面具有较大的实用价值。

胃泌素前体释放肽(ProGRP)和神经化烯醇酶(NSE)是提示小细胞肺癌(SCLC)的血清肿瘤标志物，ProGRP是烯醇化酶同功酶，烯醇化酶同功酶根据α，β，γ三个亚基的不同，可分为αα，ββ，γγ，αβ和αγ五种二聚体同功酶。α亚基主要存在于肝，肾等组织；β亚基主要存在于骨骼肌和心肌；γ亚基主要存在于神经组织。γγ亚基组成的同功酶属神经元和神经内分泌细胞特有，故命名为神经元特异性烯醇化酶，此酶在正常人脑组织中含量最高，起源于神经内分泌细胞的肿瘤组织也有异常表达，NSE分子量为87000，pH4.7，是一种酸性蛋白酶，参与糖酵解，主要作用是催化2-磷酸-甘油变成烯醇式磷酸丙酮酸。癌组织糖酵解作用加强，细胞增殖周期加快，细胞内的NSE释放进入血液增多，导致此酶在血清内含量增高。适用于SCLC的早期诊断，以及与NSCLC的鉴别诊断。

胃泌素前体释放肽(ProGRP)是NSE胃泌素释放肽(GRP)相对稳定的前体，是近年来发现的一种新的SCLC肿瘤标志物，它不仅可用于SCLC的早期发现，还有助于判断疗效及肿瘤复发。而ProGRP位于胃泌素释放肽的前端，由27个氨基酸组成，在血液中较为稳定。是测定小细胞肺癌的良好标志物。有助于SCLC的分期和评估化疗效果。

将ProGRP和NSE联合检测，优势互补，能显著提高SCLC的诊断敏感度，特异度和准确率，在SCLC诊断和治疗中有重要的临床应用价值。

发明内容

本发明的目的在于利用电化学的基本原理，提供一种可同时检测多种蛋白如检测胃泌素前体释放肽和神经化烯醇酶的电化学免疫方法。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种同时检测样品中多种蛋白含量的电化学免疫分析方法，包含以下步骤：

步骤1：使包裹不同电化学分子的脂质体与不同待测蛋白的抗体形成共偶合物，每种待测蛋白对应唯一一种电化学分子；

步骤2：向固载了多种待测蛋白的抗体的微孔板中加入待测蛋白标准溶液或待测样品，充分反应后，洗涤，封闭非特异结合位点；再向微孔板中加入步骤1制备的共耦合物，充分反应后，除去非特异性吸附的脂质体，加入表面活性剂使脂质体破乳；

步骤3：线性扫描伏安法检测不同电化学分子的电流信号强度，根据标准溶液浓度及电流信号强度绘制标准曲线，根据标准曲线得到待测样品中不同蛋白的浓度。

作为优选，所述蛋白种类为两种。

作为优选，所述蛋白为胃泌素前体释放肽和神经化烯醇酶。

作为优选，所述电化学分子种类为两种。

作为优选，所述电化学分子为尿酸和抗坏血酸。尿酸UA、抗坏血酸AA是具有电化学活性的芳香族双质子分子，在一定的电压下能够发生氧化还原反应，可以作为电化学免疫传感器的氧化还原探针分子。利用脂质体的空腔结构包埋电活性小分子如铁氰化钾，二茂铁、光化学活性分子、核酸、酶等，可以用于构建高灵敏免疫传感器。

在具体实施例中，本发明采用超声降解法，分别制备包裹具有电化学分子活性的尿酸和抗坏血酸的脂质体，以此作为信号放大的载体，利用免疫反应的高特异性，结合电化学的高灵敏性。

当固载的抗体与待测蛋白发生特异性结合后，再用表面固定了可与待测蛋白特异性结合的检测抗体的内部包埋了不同电化学分子的脂质体进行检测，形成“三明治”夹心形式，用表面活性剂破乳，释放出电化学分子，借助不同电活性分子在不同电位下具有特征的伏安峰的特性，利用修饰电极通过检测不同电化学分子的线性扫描伏安(LSV)峰电流信号强度，根据标准曲线来检测样品中对应的待测蛋白的浓度，电流响应值与待测蛋白浓度成正比。

在本发明的具体实施例中，包裹在脂质体内的电化学分子为尿酸和抗坏血酸，所检测的蛋白为胃泌素前体释放肽和神经化烯醇酶。所述表面活性剂为Triton-100。

在本发明的具体实施例中，步骤3所述检测具体为：以MWNT修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极，检测电化学分子的峰电流强度。

所述MWNT修饰玻碳电极为浓度为1.0mg/mL、充分分散的MWNT的5％DMF溶液滴涂的玻碳电极。