[发明专利]一种用于多重LAMP检测的微流控芯片及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于核酸等温扩增技术领域，具体涉及一种用于多重LAMP检测的微流控芯片及其制备方法和用途。

技术背景

等温核酸扩增是相对聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction, PCR)变温核酸扩增而言的。该技术可以不依赖温度循环仪等昂贵仪器，在恒定温度下就可以大量扩增核酸，近年来受到学术界和产业界的高度重视，相继开发出多种类型的等温核酸扩增。环介导等温核酸扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）最早由日本科学家发明，该技术具有灵敏度高，特异性好，反应速度快，反应结果可以直接肉眼判定等优点，经过近10年的学术研究和临床验证，取得了近400项项关专利，并以各种检测试剂盒的形式进入市场。但是LAMP反应的“等温模式”和其复杂的核酸探针使其不能实现一个样品中多种目标物的同时检测，即多重检测（即同时检测一个样品中多种目标物）。微流控芯片技术的发展为我们提供了一个十分有效的解决方案。本发明在有关项目的支持下，利用微流控芯片相关技术顺利地攻克了LAMP检测的多重性难题。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以用于多重LAMP检测的微流控芯片及其制备方法和用途。

本发明提供的用于多重LAMP检测的微流控芯片，在结构上主要包括三个部分：扩增池，连接管道和毛细管通道。见附图1所示。扩增池中包被上针对目标物的特异性探针。扩增池可以按各种形式空间有序排列，如阵列状或发散状等。其数量可以根据目标物检测的需求设计，如三重，五重或十重等等，不受限制。空间有序排列的系列扩增池通过信号的空间区分来实现多重LAMP信号的有效区分。毛细管通道主要是利用其物理限域（低质量传递系数）的特性限制每个扩增池中的特异核酸探针和反应产物在不同池中的交叉污染，即毛细管的小尺度结构使其中的流体具有很小的扩散系数,可以有效阻止LAMP引物，扩增产物和副产物（如焦磷酸镁等）在不同扩增池之间的相互交叉混合。同时也利用毛细管的拉力便于样品和反应液的进样。扩增池和毛细管之间用连接管道连通，使流体平稳均匀的从毛细管通道流入扩增池，并避免反应过程中形成汽泡。

本发明还提供上述微流控芯片的制备方法，具体步骤如下：

1）芯片模板的制作：利用传统MEMS的方法制作芯片模板。

2）芯片浇注,脱气,固化：将二甲基硅氧烷和固化剂混合均匀后,倾倒于芯片模板上,真空脱气，高温固化。

3）芯片打孔，封合：用注射器针头在芯片进样处打孔，通过等离子处理后，与玻片永久键合。

4）功能化芯片：将被检核酸目标物对应的探针通过注入-蒸发法包被于芯片对应的扩增池中，完成功能化芯片。

本发明方法可以制成各种类型(包括芯片尺寸大小，扩增池排列和数目等)的聚合物多重LAMP检测芯片。而且通过注入-蒸发法可以很方便的完成各种功能芯片, 且不产生交叉污染。

本发明的微流控芯片的验证：

本发明利用LAMP扩增体系对芯片的有效性进行验证。在十通道微流控芯片中，在第1, 2, 3, 4扩增池中包被上针对四种核酸目标物的特异性探针（Probe 1, Probe 2, Probe 3, Probe 4），在第5扩增池中不包被核酸探针。通入样品（含四种目标核酸），再通入LAMP反应液，在恒温下LAMP反应30 min-60 min。实验结果如附图2，在包被有目标物探针的扩增池中出现了LAMP信号（c）白色沉淀，（d）绿色荧光；琼脂糖凝胶电泳中也出现了特征性的LAMP梯状扩增带(e)。而在没有包被核酸探针的扩增池中不出现LAMP信号，电泳分析没有出现扩增条带。

使用本发明微流控芯片的基本操作步骤如下：

1）样品注入: 用移液枪将被检样品加到芯片加样池，然后加入一定量的LAMP扩增液。在毛细管的拉力下,样品和扩增液迅速均匀地分布进入扩增检测池。

2）恒温扩增：用未固化的聚二甲基硅氧烷将芯片封合，在水浴锅中进行恒温反应约30 min-60 min。

3）结果判断:可以直接根据扩增池中白色沉淀产生与否判定检测结果，也可以在紫外灯下根据是否产生荧光来判定结果。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1）本发明通过芯片上扩增池空间位置不同实现多重LAMP信号的有效区分，结果直观，效果明显，不需要借助其他昂贵仪器，非常有利于LAMP方法在基层的推广和应用。

2）通过MEMS芯片制作法，可以根据需要实现扩增池在芯片上任意的空间排列。