[发明专利]一种基因芯片制备方法及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及检测技术领域，尤其涉及的是一种可以快速检测鉴别禽流感病毒主要亚型及同时可检测新城疫病毒、鸡减蛋综合症病毒的基因芯片。

背景技术

目前对于鉴别禽流感（Avian influenza, AI）亚型及新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、鸡减蛋综合症病毒(EDS-76)的检测主要是血清学和PCR方法。血清学方法特异性好，是禽流感亚型鉴别及新城疫、鸡减蛋综合症的常用方法，但操作过程较为繁琐费时，并且禽流感变异较快亚型众多，用已知HA亚型的抗血清无法检出新出现的亚型，所以该方法无法达到快速准确检测的要求。PCR技术灵敏度高并且快速，相对于传统方法而言大大缩短了检测过程，在此方法基础上发展起来的荧光PCR、荧光RT- PCR又进一步提高了灵敏度，但其缺点是容易出现假阳性以及一次反应只能鉴别少数几种病原，所以也无法通过一次反应快速鉴别禽流感亚型的要求。尤其对于检验检疫部门，有时会要求同时检测几种不同的病原，在这种情况下，建立一种快速准确而且又能同时检测几种不同病原的方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴别禽流感病毒通用型及区分禽流感病毒亚型H4、H5、H6、H7、H9、N1、N2、N9，同时又能检测新城疫病毒、鸡减蛋综合症病毒的基因芯片的制造方法及其使用方法。

本发明的技术方案如下：

一种基因芯片，其中，所述基因芯片的基质膜上固定有用于鉴别禽流感通用型及区分H4、H5、H6、H7、H9、N1、N2、N9亚型，同时又能检测新城疫病毒、鸡减蛋综合症病毒的特异性探针；

禽流感病毒通用型特异性探针序列如SEQ NO.1所示；禽流感病毒H4特异性探针序列如SEQ NO.2所示; 禽流感病毒H5特异性探针序列如SEQ NO.3所示；禽流感病毒H6特异性探针序列如SEQ NO.4所示; 禽流感病毒H7特异性探针序列包括2条，分别如SEQ NO.5~6所示；禽流感病毒H9特异性探针序列如SEQ NO.7所示; 禽流感病毒N1特异性探针序列包括2条，分别如SEQ NO.8~9所示；禽流感病毒N2特异性探针序列如SEQ NO.10所示; 禽流感病毒N2特异性探针序列包括2条，分别如SEQ NO.11-12所示; 新城疫病毒NDV特异性探针序列包括2条，分别如SEQ NO.13-14所示; 鸡减蛋综合症病毒EDS-76特异性探针序列如SEQ NO.15所示。

所述的基因芯片，其中，所述特异性探针的5’端标记15-30 Poly T。

所述的基因芯片，其中，所述基质膜为硅晶片、玻璃或高分子。

一种上述的基因芯片的制备方法，其中，包括以下步骤：

S1、在GenBank上分别选取禽流感病毒的M1、H4、H5、H6、H7、H9、N1、N2、N9以及NDV、EDS-76 基因序列，利用生物信息学软件Primer Express 2.0设计特异性探针；

S2、合成特异性探针；

S3、使用DR. Fast Spot芯片点样仪系统将特异性探针按照预先设计的矩阵点样，室温干燥10min；每份基因芯片均至少包含一个阳性对照和一个阴性对照；

S4、用紫外交联仪照射基因芯片7~10分钟，照射能量为1.2J，以固定特异性探针，最后依次用Milli-Q水和95%乙醇洗涤，干燥。

所述的基因芯片的制备方法，其中，所述S2步骤还包括：在特异性探针的5’端标记15-30 Poly T，以使特异性探针固定在基质膜上。

所述的基因芯片的制备方法，其中，所述阳性对照为多聚PolyT，阴性对照为ddH₂O。

一种上述的基因芯片的检测方法，其中，包括以下步骤：

S1、检测病原特异性引物设计：在GenBank上分别选取禽流感病毒的M1、H4、H5、H6、H7、H9、N1、N2、N9以及NDV、EDS-76 基因序列，利用生物信息学软件Primer Express 2.0设计病原特异性引物；并在每种病原对应引物对的上游引物标记生物素biotin；

S2、核酸提取：使用DNA/RNA磁珠提取试剂盒提取待测样品的核酸，获取下一步核酸扩增用的模板；

S3、进行PCR扩增：使用One Step RT-PCR试剂盒，按照试剂盒说明书上的步骤进行PCR扩增；