[发明专利]一种棉花种子纯度检验的方法

权利要求书

1.一种国丰棉198棉花种子纯度检验的方法，其特征在于其具体步骤是：

DNA提取：

将种子置于营养钵中发芽出苗至幼苗有2-3片真叶时，取4cm左右的叶片于研钵中，加入1.5×CTAB提取缓冲液将其研碎，转入离心管65℃水浴半小时；加入与提取缓冲液等体积的氯仿/异戊醇混合液，手摇10分钟，10000rpm离心10分钟；取其上清，加入冰冻95%乙醇，-20℃冰柜内放置30分钟沉淀DNA；10000rpm离心10分钟，弃上清，加75%乙醇，静置4分钟去盐；弃乙醇，离心管倒置于吸水纸上风干；加200ul灭菌双蒸水溶解DNA待用；

2）PCR反应：

在PCR管中分别加入DNA模板、10×PCR含氯化镁缓冲液、三磷酸脱氧核糖核苷、引物P1和P2、Taq酶及双蒸水；先94℃预变性4′；再94℃变性30″，55℃退火30″，72℃延伸1′，32个循环；72℃延伸7′，95℃水浴4′变性后置冰上；

3）注胶电泳检测：

将分离胶缓慢注入两玻璃板之间，静置凝固半小时以上；将玻璃板装上电泳槽，2000V，90W预热半小时；插梳子，点样；2000V，85W电泳约3小时；下胶后，将胶板放在10%冰醋酸的盒子里，轻摇20分钟至胶全部脱色；用清水漂洗两次，每次5分钟；放入染色盆染色液中,轻轻摇动染色15-20分钟；取出胶板，用清水漂洗10秒；放入显影液中显影至DNA带清晰；水洗1分钟；

4）受检种子纯度计算：

用上述方法分别获取国丰棉198杂交一代和亲本种子电泳谱带，计数受检样品中有清晰的两条带型的种子数，并用下式计算受检样品的种子纯度（%）=受检样品中有清晰的两条带型的种子数/受检种子总数×100。

2.根据权利要求1所述的一种国丰棉198棉花种子纯度检验的方法，其特征在于：所述1.5×CTAB提取缓冲液由1.5%(w/v)的十六烷基三甲溴化铵,1.4M的氯化钠，100mM的 Tris-Cl缓冲液，20mM 的乙二胺四乙酸，0.2%（v/v）的α-巯基乙醇构成。

3.根据权利要求1所述的一种国丰棉198棉花种子纯度检验的方法，其特征在于：所述氯仿/异戊醇混合液由氯仿和异戊醇混合而成，其混合体积比为24︰1。

4.根据权利要求1所述的一种国丰棉198棉花种子纯度检验的方法，其特征在于：所述PCR反应体系中引物P1序列为5’-CGGTCAGATTCCAACAGA-3’,引物P2序列为5’-GCCATCTCAGAGAGGACA-3’。

5.根据权利要求1所述的一种国丰棉198棉花种子纯度检验的方法，其特征在于：所述分离胶由4%的聚丙烯酰胺、10%的过硫酸铵和N,N,N',N'-四甲基乙二胺混合而成，其混合体积比为65:0.4:0.04。